病原学检查方法

　　A1 乙型病毒性肝炎病原学诊断标准

　　本标准要求以ELISA法检测HBV标志物，要求使用符合质控标准的试剂盒。具体操作步骤如下：

　　HBsAg

　　ELISA双抗体夹心法操作步骤：

　　1.抗-HBs纯品包被聚苯乙烯板孔，每孔0.1mL，4℃过夜。

　　2.洗液洗4次。

　　3.加待检血清，每孔0.1mL，放37℃ 2h或43℃ 1h。

　　4.洗液洗4次。

　　5.加抗-HBs酶标记物，每孔0.1mL，放37℃2h或43℃ 1h。

　　6.洗液洗4～5次，拍干。

　　7.加底物，每孔0.1mL，置室温避光15～30min，加2mol/L硫酸30μL终止反应。

　　8.结果判断：

　　目测：

　　阳性为显色；阴性为无色。

　　应用酶标仪测读OD值：

　　标本OD值大于等于2.1倍阴性对照OD值为阳性。

　　标本OD值小于2.1倍阴性对照OD值为阴性。

　　抗－HBs

　　ELISA双抗原夹心法操作步骤：

　　1.HBsAg纯品包被聚苯乙烯板孔，每孔0.1mL，4℃过夜。

　　2.洗液洗板4次。

　　3.加待检血清，每孔0.1mL，37℃ 2h或43℃ 1h。

　　4.洗液洗板4次。

　　5.加HBsAg酶标记物，每孔0.1mL，37℃2h或43℃1h。

　　6.洗液洗板4～5次，拍干。

　　7.加底物，每孔0.1mL，置室温避光15～30min，加2mol/L硫酸30μL终止反应。

　　8.结果判断：

　　目测：

　　阳性为显色；阴性为无色。

　　应用酶标仪测读OD值：

　　标本OD值大于等于2.1倍阴性对照OD值为阳性。

　　标本OD值小于2.1倍阴性对照OD值为阴性。

　　HBeAg

　　ELISA双抗体夹心法操作步骤：

　　1.抗-HBe纯品包被聚苯乙烯板孔，每孔0.1mL，4℃过夜。

　　2.洗液洗4次。

　　3.加待检血清，每孔0.1mL，37℃ 2h或43℃ 1h。

　　4.洗液洗4次。

　　5.加抗－HBe酶标记物，每孔0.1mL，37℃ 2h或43℃ 1h。

　　6.洗液洗4～5次，拍干。

　　7.加底物，每孔0.1mL，置室温避光15～30min，加2mol/L硫酸30μL终止反应。

　　8.结果判断：

　　目测：

　　阳性为有色；阴性为无色。

　　应用酶标仪测读OD值：

　　标本OD值大于等于2.1倍阴性对照OD值为阳性。

　　标本OD值小于2.1倍阴性对照OD值为阴性。

　　抗－HBe

　　ELISA中和法检测步骤：

　　1.抗－HBe纯品包被聚苯乙烯板孔，每孔0.1mL，4C过夜。

　　2.洗液洗4次。

　　3.每孔加待查标本0.05mL，加中和试剂0.05mL（HBeAg）于中和板内，置37℃ 2h或43℃ 1h。

　　4.加HBeAg纯品，每孔0.1mL，置37℃ 2h或43℃ 1h。

　　5.洗液洗4次。

　　6.加抗－HBe酶标记物和待检血清，每孔各0.1mL，置37℃ 2h或43℃ 1h。

　　7.洗液洗4～5次，拍干。

　　8.加底物，每孔0.1mL，室温避光15～30min，加2mol/L硫酸30μL终止反应。 9.结果判断：

　　目测：

　　阳性为无色；阴性为显色。

　　应用酶标仪测读OD值，计算抑制率：

　　抑制率大于等于50％为阳性。

　　抑制率小于50％为阴性。

　　抗－HBc

　　ELISA竞争法检测步骤：

　　1.HBcAg纯品包被聚苯乙烯板孔，每孔0.1mL，4℃过夜。

　　2.洗液洗4次。

　　3.加待检血清和抗－HBc酶标记物，每孔各0.05mL，放37℃ 2h或43℃ 1h。

　　4.洗液洗4～5次，拍干。

　　5.加底物，每孔0.1mL，室温避光15～30min，加2mol/L硫酸30μL终止反应。

　　6.结果判定：

　　目测：

　　阳性为无色；阴性为显色。

　　应用酶标仪测读OD值：

　　标本OD值大于等于2.1倍阳性对照OD值为阴性。

　　标本OD值小于2.1倍阳性对照OD值为阳性。

　　分光光度计测OD值（492nm）

　　抑制率大于等于50％为阳性（＋）。

　　抑制率小于50％为阴性（－）。

　　抗－HBc　IgM

　　1.抗μ血清包被聚苯乙烯板孔，每孔0.1mL，4℃过夜。

　　2.洗液洗4次。

　　3.加待检血清，每孔0.1mL，放37℃ 2h或43℃ 1h。

　　4.洗液洗4次。

　　5.加HBeAg，每孔0.1mL，放37℃ 2h或43℃ 1h。

　　6.洗液洗4次。

　　7.加抗-HBc酶标记抗体，每孔0.1mL，放37℃ 2h或43℃ 1h。

　　8.洗液洗4次，拍干。

　　9.加底物，每孔0.1mL，置室温避光15～30min，加2mol/L硫酸30min终止反应。

　　10.结果判定：

　　目测：

　　阳性为显色；阴性为无色。

　　应用酶标仪测读OD值：

　　标本OD值大于等于2.1倍阴性对照OD值为阳性。

　　标本OD值小于2.1倍阴性对照OD值为阴性。

　　抗－HBc IgG

　　1.抗γ血清包被聚苯乙烯板孔，每孔0.lmL，4℃过夜。

　　2.洗液洗4次。

　　3.加待检血清，每孔0.1mL，放37℃ 2h或43℃ 1h。

　　4.洗液洗4次，拍干。

　　5.加HBcAg，每孔0.1mL，放37℃ 2h或43℃ 1h。

　　6.洗液洗4次，拍干。

　　7.加抗-HBc酶标记抗体，每孔0.1mL，放37℃ 2h或43℃ 1h。

　　8.洗液洗4次，拍干。

　　9.加底物，每孔0.1mL，置室温避光15～30min，加2mol/L硫酸30min终止反应。

　　10.结果判定：

　　目测：

　　阳性为显色；阴性为无色。

　　应用酶标仪测读OD值：

　　标本OD值大于等于2.1倍阴性对照OD值为阳性。

　　标本OD值小于2.1倍阴性对照OD值为阴性。

　　HBV 感染的标记物判定标准

　　（1）血清HBsAg阳性。

　　（2）血清HBV DNA阳性（斑点杂交法），或HBV DNA多聚酶阳性，或HBeAg阳性（单独HBeAg阳性，需要作中和试验，以排除假阳性），血清抗-HBc IgG阳性（单独阳性，需要作中和试验，排除假阳性）。

　　（3）肝内HBcAg阳性和（或）HBsAg阳性，或HBV DNA阳性。

　　有以上任何一项阳性者可诊断为HBV感染。

　　A2 急性HBV感染标记物诊断标准

　　（1）病程中HBsAg由阳性转为阴性，或HBsAg由阳性转为阴性且出现抗-HBs阳转。

　　（2）抗－HBC IgM滴度高水平，而抗－HBc IgG阴性或低水平。

　　A3 慢性HBV感染标记物诊断标准

　　抗-HBc IgM滴度不高或阴性，但血清HBsAg或HBV DNA任何一项阳性病程持续半年以上。