流脑病原学诊断方法

　　A1 病原体（脑膜炎奈瑟氏菌Neissria meningitidis）分离

　　从疑似流脑患者采集CSF或急性期血液分离Nm。

　　A1.1 标本的采集

　　A1.1.1 CSF：无菌操作，吸出CSF 2mL，立即放到无菌试管内离心（2000～3000r/min，30min），用灭菌过的毛细管吸取沉淀物直接接种到10％羊血巧克力色琼脂上（CSF上清液部分供检测Nm特异抗原，亦可将其置于－20℃待测），5％二氧化碳环境37℃培养24～72h，每日检查细菌生长的情况，及时分离纯培养物供鉴定。

　　A1.1.2 血液：采取病人急性期静脉血液6mL，无菌操作往盛有30mL增菌用的葡萄糖肉汤三角瓶内注入4mL血液（余下的2mL血液同上离心后吸出血清，供检测Nm特异抗原和抗体，亦可将其置于一20℃待测），同上述条件培养24～72h，每日进行分离培养。

　　A1.2 接种和菌种鉴定

　　A1.2.1 细菌形态：Nm应为革兰氏阴性，呈卵圆形或肾形，0.8μm×0.6μm大小。常成对排列，临近两边扁平凹陷。

　　A1.2.2 菌落：Nm接种于巧克力色琼脂平皿上，5％二氧化碳，37℃培养24h后，其菌落直径约1mm，表面突起、光滑、湿润、圆整、略带灰白色、半透明、不溶血、无色素。培养时间延长，菌落增大、变成黄色、不透明，并可出现颗粒状中心和放射性周边。

　　A1.2.3 生长及抗原特性：绝大多数Nm菌株分解葡萄糖和麦芽糖，产酸不产气。不分解蔗糖、果糖和乳糖。过氧化酶和氧化酶阳性。

　　Nm新分离菌株具有下列主要抗原：血清群特异性荚膜多糖，主要外膜蛋白－OMP（包括血清型特异的2/3类OMP，亚型特异的1类OMP以及4与5类OMP），铁调节蛋白，脂寡糖（LOS），H.8脂蛋白，还有菌毛抗原等，根据群特异性荚膜多糖的结构与组成成分，Nm可分为13个血清群（A、B、C、D、29E、H、I、K、L、W135、X、Y、Z），其中90％以上的病例是由A、B和C群Nm引起的。根据2/3类OMP可将B群与C群Nm分成20个血清型，但差不多半数菌株目前尚不能分型。在可分型菌株中，以15、2和4型，P1.2、P1.1、P1.12、P1.15及P1.16亚型多见；对于A群Nm现有4与21两个血清型，以P1.7与P1.9亚型多见。Nm还可以分成13个LOS免疫型，其中A群以L10和L11型多见，B群中以L3，7，9复合型多见。Nm群特异性荚膜多糖、型和亚型的OMP及LOS等抗原成分对流脑发病与流行及其菌苗的研究均具有重要价值。