急性出血性结膜炎的实验室检测
一、病毒的分离与鉴定
（一）标本的采集、运送和保存
1.患眼结膜囊泪液、分泌物是分离CA24v、EV70的主要标本。标本采集应在起病1～3天以内。
2.用灭菌棉拭子涂擦翻转的上、下睑结膜并拭取泪液立即投入装有灭菌生理盐水或Eagle液或0.5%水解乳蛋白Hanks液2mL的小试管中，贴好标签，置冰壶内携至实验室或低温（-20℃～-70℃）冻存。
（二）病毒分离
1.取出标本，无菌条件下揉洗棉拭子，压挤出标本液，加10％青霉素、链霉素（原浓度青霉素、链霉素各1万u/mL），置4℃作用4h后用作病毒分离。
2.细胞培养用生长单层的HeLa细胞或人胚肺二倍体细胞或其他敏感细胞，生长液为10%牛血清Eagle液，含青霉素100u/mL，链霉素100u/mL，pH7.2～7.4。
3.倾去细胞管内生长液。每细胞管接种标本液0.2mL吸附10min。每份标本液接种4个细胞管。加维持液（含2%牛血清的Eagle液，PH7.2～7.4）0.8mL/管。余标本液置-20℃或-70℃冻存。细胞对照管4管，每管加维持液1.0mL。37℃温箱静置培养。每日光学显微镜下观察细胞病变。3～4天更换维持液一次，连续观察7天。
4.细胞管出现细胞病变，表现为细胞圆缩、分散、胞浆内颗粒增加，最后细胞自管壁脱落，为分离阳性结果。细胞病变达“+++～++++”时，将细胞收留冻存于-20℃或-70℃，备TCID50滴定及病毒鉴定。第1代培养见可疑细胞病变时继续传代，待细胞病变稳定出现后-20℃或-70℃冻存。第1代培养培养7日不出现细胞病变时连续盲传2代，如仍无细胞病变则分离结果为阴性。
（三）病毒TCID50滴定
1.阳性细胞管冻融3次。2000rpm离心10分钟，吸取上清，加Eagle液10倍系列稀释为10-1至10-8病毒液，各加入细胞板内，每孔25μl，每稀释度4孔细胞。
2.每孔加细胞悬液25μl，同时设细胞对照（25μl稀释液+25μl细胞悬液），37℃培养7天，观察细胞病变。
3.按Reed-Muench法计算出分离病毒株的TCID50。
（四）病毒鉴定（微量中和实验）
1.将CA24v或EV70的标准血清稀释至20个单位（例如：血清效价为1：160时，进行1：8稀释）。
2.在96孔细胞培养板中每孔加入20个单位的标准抗血清25μl和100个TCID50病毒25μl，37℃作用1小时，最后加入HeLa或其它敏感细胞悬液25μl.同时设以下对照：
（1）病毒滴度核实对照：第一孔加100个TCID50病毒25μl，从第二孔开始进行倍比稀释病毒最后每孔加稀释液25μl及细胞悬液25μl；
（2）阳性对照：加100个TCID50病毒25μl、稀释液25μl和细胞悬液25μl；
（3）阴性对照：加稀释液50μl和细胞悬液25μl；
（4）阴性血清对照：每孔加100个TCID50病毒25μl、不含特异性抗体的血清25μl和细胞悬液25μl；
（5）将细胞板轻轻摇匀，37℃、5％CO2温箱培养7天。
3.观察细胞病变，以完全病变为判断标准，不发生细胞病变的证明其病毒能被标准血清所中和，以此鉴定病毒。
二、间接免疫荧光试验法
（一）眼结膜细胞涂片
1.用棉拭子取结膜细胞，涂于清洁的玻片上，室温干燥，冷丙酮于4℃固定10min。
2.一个患者标本作两个涂片，分别用抗CA24v及抗EV70单克隆抗体作间接免疫荧光试验，检查结膜细胞中的病毒抗原。
（二）细胞培养物涂片
1.眼拭子标本接种于细胞培养管中，出现可疑细胞病变时，取其中一管用毛细吸管吹打下细胞，经PBS洗涤做细胞涂片，室温干燥，冷丙酮固定。
2.分别用抗CA24V及抗EV70单克隆抗体作间接免疫荧光试验检查病毒抗原，既可以确定分离是否为阳性，又可以及时鉴定出病毒型别。
（三）间接免疫荧光试验法
1.上述结膜细胞涂片或病毒分离涂片，分别加适当稀释的抗CA24v及抗EV70单克隆抗体，将玻片置于37℃湿盒内30min。
2.取玻片用pH7.2～7.4的PBS洗涤3次，每次3min～5min。
3.加适当稀释的抗鼠IgG荧光素结合物，置于37℃湿盒内30min。
4.取出玻片，同上法用P.B.S洗涤3次，加50%中性甘油P.B.S封片镜检，在荧光显微镜下细胞浆内见黄绿色荧光为阳性。
5.在实验中设阴性或阳性对照。
（三）血清学检查
1.发病1～3天内采取患者急性期血清，发病后2～4周采取恢复期血清，分别-20℃冻存备检。
2.双份血清1：5稀释，56℃，30分钟灭活。
3.在96孔细胞培养板上将上述血清从1：5开始倍比稀释至1：1280，每孔量为25μl。
4.每孔加100个TCID50病毒25μl，37℃作用1小时，加细胞悬液25μl，置37℃、5%CO2温箱培养7天。以完全病变为判断标准，与哪型病毒中和即判断为该型病毒感染。
5.光学显微镜下观察细胞病变，以不产生细胞病变的血清最高稀释度的倒数为终点效价。
