实验诊断方法

　　A1 病原学诊断方法

　　A1.1 细菌培养

　　A1.1.1 标本收集

　　按不同病期采集不同种类的标本。

　　A1.1.1.1 血标本宜在病程的第1～2周采集，但只要发热未退，两周以后仍可获得阳性结果，采血量不少于5～10mL，已用氯霉素者取血凝块作培养。

　　A1.1.1.2 骨髓培养宜在病程的第1～2周送检。

　　A1.1.1.3 粪便标本宜在病程的第3～4周送检。

　　A1.1.1.4 尿标本宜在病程的第3～4周送检，阳性率较低，采集时应避免粪便污染。

　　A1.1.1.5 玫瑰疹的刮取物或活检切片。

　　A1.1.2 培养

　　血液和骨髓穿刺液先进行增菌培养，粪、尿（沉渣）可直接接种于鉴别培养基，经37℃24h培养后挑选可疑菌落，进一步作生化反应和血清学鉴定。

　　A1.1.3 鉴定

　　A1.1.3.1 菌落形态：在普通培养基上伤寒杆菌形成中等大小、无色半透明的、表面光滑的菌落，菌落边缘整齐。

　　A1.1.3.2 形态染色：伤寒杆菌为革兰氏阴性杆菌，属沙门氏菌属D组，无芽胞、无荚膜、有动力，为周身鞭毛菌，有菌毛。

　　A 1.1.3.3 生化反应：不分解乳糖、蔗糖及鼠李糖，能分解葡萄糖，产酸不产气，赖氨酸脱羧酶阳性，谷氨酸脱羧酶阴性，甲基红试验阳性。副伤寒杆菌形态与伤寒杆菌相似，能分解葡萄糖，产酸产气。

　　A2 血清学诊断方法

　　伤寒的经典血清学诊断方法是肥达氏反应（试管法），目前已采用微量凝集试验。

　　A2.1 原理

　　用标准伤寒、副伤寒甲、乙、丙菌液与稀释的待测血清反应，根据凝集效价判断待测血清中有无抗伤寒杆菌的抗体。与传统肥达氏反应不同，此试验在微量血凝反应板上操作。

　　A2.2 试剂

　　取伤寒O、H诊断菌液（70亿菌/mL），分别用生理盐水稀释成10亿菌/mL.为便于观察，每10mL此种稀释菌液中加入石炭酸复红（抗酸染色用染液）10μL，或加20.0g/L美蓝溶液50μL。

　　A2.3 操作

　　A2.3.1 于血凝反应板孔内稀释待测血清，用每滴25μL的校正滴管滴加生理盐水9滴于孔内，再加待测血清1滴混匀（1∶10稀释）。

　　A2.3.2 于8×12孔U型孔血凝反应板上操作，每份待测血清用5排孔，分别标以O、H、甲、乙、丙，每排自第二孔开始每孔注加生理盐水25μL至第8孔。

　　A2.3.3 吸取1：10稀释待测血清，分别滴入各排第1、2孔中各1滴（25μL），用稀释棒从第2孔开始作双倍连续稀释至第7孔，第8孔不加血清，留作菌液对照。

　　每批试验可用伤寒、副伤寒诊断血清作阳性对照，同法稀释。

　　A2.3.4 各排分别滴入相应的染色菌液，每孔1滴（25μL），此时各孔液体总量为50μL，第1～7孔血清最终稀释度为1∶20～1∶1280。

　　A2.3.5 于混匀器上混匀1min，血凝反应板加盖，37℃6h后观察结果。

　　A2.4 结果判断

　　阳性结果表现为液体澄清，有红色或蓝色细颗粒，均匀平摊于整个孔底；阴性表现为蓝或红色菌体集中一点，沉积于孔底，与菌液对照相同。以出现50％（2＋）凝集的血清最大稀释倍数的倒数为待检血清滴度。

　　A2.5 参考值

　　与传统肥达氏反应相同，即在一般情况下，O凝集价≥1∶80，H凝集价≥1∶160才有诊断价值。但在高发区，许多正常人因既往感染亦可有较高滴度，此时最好首先检查当地人群免疫水平，确定正常值。如双份血清效价有4倍以上增长更有意义。