病原学诊断方法

　　B1 标本采取

　　于脐部未进行消毒处理和注射破伤风抗毒素之前，用无菌棉棒于脐部化脓部位深处取脓汁及坏死组织，至少应同时取两份标本，一份用做涂片镜检，另一份做动物试验。

　　B2 直接镜检

　　取上述标本直接涂片，革兰氏染色后镜检，观察菌体的大小、形态及特征，菌体长2～5μm，宽0.4～0.5μm，两端钝圆，无荚膜。本菌为革兰氏阳性细菌。鞭毛染色镜检，可见周身鞭毛。

　　B3 分离培养

　　破伤风杆菌为专性厌氧菌，需在厌氧培养设备（厌氧箱、厌氧罐或厌氧袋）中处理标本。将标本分别接种于数管肉渣汤及牛乳培养基上加盖凡士林，然后取其中1～2管加热80℃10min以杀死无芽孢菌。其余各管不加热，皆放在37℃孵育，观察细菌生长情况，做涂片染色镜检。

　　在37℃培养的标本，48h后即能生成芽孢，成熟的芽孢为正圆形，未成熟的芽孢为卵圆形，芽孢较菌体直径大，芽孢位于菌体的顶端将菌体膨胀呈鼓槌状。

　　另将标本涂于血琼脂平皿上（培养基中加适量新霉素以抑制杂菌生长）行厌氧培养，挑取菌落进行生化反应鉴定。

　　B3.1 破伤风杆菌在不同培养基上的生长情况：

　　B3.1.1 在肉渣汤培养基中37C培养，生长良好，培养上清液可见轻度混浊，并产生少量气体，肉渣不变黑也不被消化。

　　B3.1.2 在牛乳琼脂培养基上37C培养，可使培养基变混浊。

　　B3.1.3 在血琼脂培养基上37C培养3d，菌落周围出现α溶血环，以后转成β溶血环。

　　B3.1.4 在琼脂平板培养基上，4d可生长出直径2～5mm大小的圆形菌落。菌落中心结实，周围疏松呈棉絮状，菌落灰黄色，半透明，表面粗糙。边缘不整齐，在分离培养时，由于细菌容易在培养基表面扩散，常形成一薄膜，以致获得纯菌落比较困难。

　　B3.1.5 用肉汤37℃培养，可出现轻度混浊和少量的颗粒沉淀，振摇不散，并有粪臭味。

　　B4 生化反应鉴定

　　B4.1 葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖发酵（分解）试验均阴性。不分解糖类但能形成吲哚。

　　B4.2 牛乳消化试验阴性。

　　B4.3 水杨苷发酵试验阴性。

　　B4.4 硝酸盐还原试验阴性。

　　B4.5 触酶试验阴性。

　　B4.6 甲基红试验阴性。

　　B4.7 美蓝试验阴性。

　　B4.8 甲基乙酰甲醇（V·P）试验阴性。

　　B4.9 甘露糖发酵阴性。

　　B4.10 甘露醇发酵阴性。

　　B4.11 脂酶发酵阴性。

　　B4.12 卵磷脂酶阴性。

　　B4.13 产生吲哚。

　　B4.14 明胶水解（液化）试验阳性。

　　B5 动物试验

　　取肉渣汤培养物，经滤菌器除去培养物中的细菌，用滤液进行动物试验。

　　方法：取三组小白鼠，每组10只。

　　甲组于后腿后尾处肌肉注射滤液0.5mL。

　　乙组先由腹腔注射1∶10的稀释的破伤风抗毒素0.5mL1h后，再注射滤液0.5mL作对照。

　　丙组注射加温100℃30min的滤液0.5mL。

　　如果培养物滤过液中有破伤风毒素存在甲组小白鼠将于12～24h内发病，出现尾部举起，腿部强直痉挛或麻痹，也可能出现全身痉挛甚至死亡。

　　其他两组小白鼠不发病。