以PCR检测病人急性期血清或CSF中Nm的DNA特异片段

　　D1 目的

　　应用PCR检查病人急性期血清或CSF中Nm的DNA特异片段，对流脑病人进行早期诊断。

　　D2 材料

　　D2.1 疑似流脑患者的CSF或急性期血清。

　　D2.2 Nm的模板DNA和正常人血清作为对照。

　　D2.3 4×dNTP。

　　D2.4 琼脂糖。

　　D2.5 溴化乙啶。

　　D2.6 Taq酶（Promega）。

　　D2.7

　　引物1为：5＇-ATTATTCAGACCGCCGGCAG-3′；

　　引物2为：5＇-CCGATAATCAGGCATCCG-3′。

　　D2.8 液体石蜡。

　　D2.9 无菌去离子水。

　　D2.10 紫外光检测器。

　　D2.11 PCR扩增仪。

　　D2.12 10×PCR反应缓冲液［500mmol/L KCl，100mmol/L Tris－HCl，（室温，pH8.3），15mmol/LMgCl₂，0.1％（W/V）］明胶。

　　D2.13 载样缓冲液（0.2％溴酚蓝，50％蔗糖）。

　　D2.14 1×TBE电泳缓冲液：

　　0.089m ol/L Tris－H₃BO₃

　　0.002mol/L EDTA

　　D2.15 电泳仪。

　　D2.16 分子量标准：λDNA－EcoR I/HindⅢ。

　　D3 扩增程序

　　在0.5mL Eppendorf管中分别加入：

　　反应物　　　　　　加样顺序　体积（μL）　　　终浓度

　　10×缓冲液　　　　         1　　　　　5.0　　　　1×缓冲液

　　4×dNTP混合物 　          2　　　　　4.0　　　　200μmol/L 每种dNTP

　　引物1　　　　　　        3　　　　　2.5　　　　1μmol/L

　　引物2　　　　　　        4　　　　　2.5　　　　1μmol/L

　　模板DNA或待检标本      5　　　　    5.0　　 　5.0ng DNA/μL

　　（标本需95℃加热5min预处理）

　　无菌去离子水　　　      6　　 　 　30.5

　　（95℃水浴10min，快速离心30s）

　　TaqDNA聚合酶 　         7　　　　　0.5 1u

　　液体石蜡　　　　　      8　　　　　25.0

　　D3.1 混匀离心，于72℃反应2min后即开始循环。循环参数如下：

　　94℃变性反应30s；

　　56℃退火反应30s；

　　72℃延伸反应60s。

　　D3.2 30个循环后再72℃延伸4min。

　　D3.3 反应结束，取出反应管冷至室温后置4℃供检测。

　　D4 扩增产物的检测

　　D4.1 取2μL反应产物与1μL载样缓冲液混合。

　　D4.2 用含溴化乙啶（0.5μg/mL）的1.2％琼脂糖凝胶检测扩增产物。

　　D4.3 75mm×48mm微型胶，以6V/cm电泳1h，电泳缓冲液为1×TBE。

　　D4.4 电泳结束后，将凝胶置紫外光检测器上观察结果、照相。

　　D4.5 扩增产物特异片段的长度为596个碱基对。