百日咳病原学诊断方法
A1 病原体分离
从病人鼻咽部采集标本或咳碟法分离病原体。
A1.1 标本的采集
A1.1.1 咳碟法
用咳碟法采集样品时，应在病人咳嗽时，将包－姜（Bordet－Gengou）二氏培养平板打开放在病人口前10cm处，使病人对准平板表面咳嗽数次，直接收集病人咳出的飞沫。然后盖好平皿盖送检。平皿暴露时间以15s为宜。
A1.1.2 鼻咽试子
由于百日咳多发于儿童，所以采样时，病儿的头部斜依于母亲的胸怀，母亲以双手固定病儿的头部，医师以右手执棉拭子，左手按病人的头顶部，使顶端稍向下弯的棉拭子自前鼻孔进入，沿下鼻道的底部向后缓缓深入，由于鼻道呈弧形，不可用力过猛，以免发生外伤出血。待棉拭子顶端到达鼻咽腔后壁时，将棉拭子稍留片刻，以待反射性咳嗽，然后轻轻旋转一周，缓缓取出棉拭子。
A1.2 接种和菌种检定
A1.2.1 菌型
百日咳杆菌应为革兰氏阴性呈卵圆形短小杆菌，菌体长0.5～1.0μm。
A1.2.2 菌落
百日咳杆菌接种于包－姜二氏培养基37℃培养3～4d后其菌落呈圆形、灰白色，表面光滑，中央突起，边缘整齐，具有珍珠般的光泽，菌落周围有弥散性溶血环。
A1.2.3 生化及抗原特性
百日咳杆菌生化反应极不活跃，不发酵任何碳水化合物，不液化明胶，不产生硫化氢，不形成吲哚，不还原硝酸盐，不利用枸橼酸盐，氧化酶阴性，70％以上菌株触酶阳性。不产生尿素酶和苯丙氨酸脱氨酶。
百日咳杆菌新分离菌株有荚膜，毒力强，菌落光滑，称为I相菌。百日咳杆菌有6种凝集因子，1、2、3因子是主要的，籍此又可将I相菌分为三种血清型：1.2，1.3，1.2.3。血清型具相对稳定性，但可发生变异。血清型不仅在自然感染，在人工传代培养过程中也可发生变异。
A2 皮肤坏死试验
A2.1 每次试验最少用健康家兔或豚鼠2只，每只家兔或豚鼠可同时试验数个菌株。
A2.2 将培养40～48h第三代或第四代20％羊血包－姜二氏培养基上的菌苔，混悬于缓冲盐水或生理盐水中。
A2.3 将菌液用灭菌脱脂棉过滤，测定浓度。
A2.4 用生理盐水将菌液稀释成4×108/mL及2×108/mL二个浓度。
A2.5 试验前一天将健康家兔或豚鼠先行脱毛。
A2.6 注射前用75％酒精消毒，再用小试管蘸色素印在脊柱两侧、每只家兔可试验4个菌株。
A2.7 每个圈内皮内注射0.1mL，拔针时要在皮内稍稍扭转以免菌液流出。
A2.8 注射完毕要做好记录。
A2.9 注射后48～72h观察坏死情况，并量坏死的大小。如两只家兔有一只注射4×108个菌，注射部位出现坏死即为阳性。
A3 免疫荧光法检测百日咳杆菌（直接法）
A3.1 原理
将已知百日咳抗血清用化学方法结合荧光色素制成荧光抗体，以此来浸染固定在玻片上的未知细菌，若为相应细菌，则两者结合面留在玻片上，不被缓冲液所冲掉。在荧光显微镜下有荧光出现。
A3.2 材料
A3.2.1 荧光抗体
用前按说明书要求以pH7.3磷酸盐缓冲盐水进行稀释，4℃冰箱保存备用。
A3.2.2 pH7.3磷酸盐缓冲盐水
氯化钠 8.5g
磷酸氢二钠 1.07g
磷酸二氢钠 0.39g
蒸馏水 1000mL
A3.2.3 荧光显微镜
A3.2.4 其他材料
0.8～1.2mm厚载玻片。0.17mm厚的盖玻片。甘油缓冲液（90mL分析纯甘油加10mL pH8.2磷酸盐缓冲液），镜油可用液体石蜡代替。
A3.3 方法
A3.3.1 用接种环将待检标本涂布于玻片上，大小约1cm2，火焰固定，用蜡笔将标本圈起。
A3.3.2 将稀释的荧光抗体加在标本上，置湿盒，放37℃温箱30min。
A3.3.3 取出玻片，用滴管吸取3～5mL磷酸盐缓冲盐水将标本上荧光抗体冲洗，再依次浸入盛有磷酸盐缓冲液三个缸中浸泡，每缸3～5min，并不时振荡。
A3.3.4 干燥、封载、镜检。
A3.3.5 为使结果正确，还需作以下对照：
a）标本阴性对照：标本不加荧光抗体只加磷酸盐缓冲盐水。
b）阳性对照：荧光抗体加在已知阳性菌株标本上。
c）封闭试验：将标本先加未标记的同样抗血清作用30min，充分洗涤后再加标记抗体染色，若是阳性标本，应无特异荧光。
d）标本加正常未免疫的标记抗体，结果应无特异荧光。
A3.4 结果判定
A3.4.1 荧光的强度和形态学的特征
＋＋＋＋：菌体显著膨大，黑心清楚，荧光明亮。
＋＋＋：菌体膨大，黑心清楚，荧光明亮。
＋＋：菌体稍膨大，形态清晰，有黑心，荧光较弱。
＋：菌体不膨大，形态不清楚，荧光微弱。
－：细菌无荧光。
A3.4.2 判定标准
阳性：细菌荧光在“＋＋”以上，在片上可看到分散或成堆出现形态典型的细菌。阳性对照“＋＋～＋＋＋”，阴性对照为阴性。
