抗原特异性IgE测定—放射变应原吸附试验（RAST）

　　C.1  原理

　　将变应原交联到固相聚合体，如葡萄糖凝胶、纤维素粒子或纸片上，然后加入被检血清。血清中的特异性抗体（1gE等）与变应原结合，洗去多余的血清，加入125I标记的抗IgE结合物，经过一定时间培育后，最后形成固相载体一变应原一特异性IgE一抗IgE、125I复合物。洗去多余的标记抗体。用Y射线计数仪测定留在纸片上的放射素含量，便可知血清中特异性IgE的含量。

　　C.2  器材

　　新华滤纸或瓦特曼I号滤纸、微量加液器、布氏滤纸、y射线计数器、负压吸引器、磁力搅拌器、pH计或试纸。

　　C.3  试剂

　　a）变应原；

　　b）溴化氰；

　　c）0.01mol／L（pH7.4）磷酸缓冲液；

　　d）5mol／L磷酸钾溶液；

　　e）0.005moL、0.1/L碳酸氢钠溶液；

　　f）马抗人IgE—IgG；

　　g）丙酮；

　　h）1mol／L、0.05mol／L乙醇胺；

　　i）0.1moI／L（pH4.0）乙酸—乙酸钠缓冲液；

　　j）牛血清白蛋白，或人血清白蛋白（HSA）。

　　C.4  方法

　　C.4.1  制备溴化氰活化滤纸片

　　华特曼I号或新华滤纸，用打孔器打成直径为6mm纸片（100片约300mg）。

　　称取4g溴化氰加80ml双蒸水，水浴溶解，搅拌。称4g纸片放火带塞三角瓶中，并用冷双蒸水浸泡 30min.吸净蒸馏水并加入5％溴化氰液80ml.用5mol／L预冷的磷酸盐调整pH在11左右，搅拌 8min，不断调整pH值。然后用0.005mol／L的碳酸氢钠800ml，分5次连续洗，再用400ml双蒸水连续洗3～4次。最后用400ml丙酮连续洗4次，放人大平皿中抽干。

　　C.4.2  制备抗原（根据抗原种类而异）

　　C.4.3  偶联蛋白：称取30mgHSA用0.1mol／L碳酸氢钠60mi溶解。每200片纸片放人HSA液15ml，在8C条件下转鼓转动48h.用0.1mol／L碳酸氢钠洗3次，0.01mol／L（pH7.4）的PBS洗3次。

　　C.4.4  偶联抗原：配制适当浓度的抗原，加入纸片后，转鼓8℃48h，之后用0.01mol／L（PH7.4）的PBS液洗3次。

　　C.4.5  封闭：将以上纸片加入0.25mol／L乙醇胺15ml，SC，转鼓8h，0.1mol／L碳酸氢钠洗3次， 0.1mol／L（pH4.0）乙酸一乙酸钠洗3次，0.01mol／L（pH7.4）PBS洗3次。4℃保存备用。

　　C.4.6  RAST试验步骤

　　C.4.6.1  将偶联过抗原及蛋白的纸片放人试管底部，每管1张。

　　C.4.6.2  将待检血清按一定稀释浓度（一般为1：5）每管加入50uL于滤纸圆盘上，另取缓冲液和阴性血清各50uL，分别加入滤纸圆盘上作为对照，加盖，室温孵育3h.

　　C.4.6.3  用负压吸引器除去各管液体后，再用含0.3％马血清的0.05mol／L（PH7.4）PBS洗3次。

　　C.4.6.4  在每管滤纸圆盘上加入125I标记的马抗人IgE抗体50uL（约5～80000CMP）。室温过夜，之后按上法洗3次。

　　C.4.6.5  吸干后用Y计数仪测放射强度（CPM／min），与正常人对照，分数大于正常均值的两个标准差 （2SD）为阳性。