血清沉淀抗体双向免疫扩散试验

　　B.1 目的

　　职业性急性变应性肺泡炎的发病机制中主要涉及Ⅲ型变态反应。在患者或有关病原物接触者的血液中常可检出与病原体抗原相应的特异性抗体。因此，进行血清沉淀抗体检测有助于对患者进行病因学诊断。

　　B.2 原理

　　将可溶性抗原和抗体，分别加入琼脂板上相对应的孔中，两者各向四周扩散，如果此抗原与抗体是相对应的，则在两者比例适宜处可形成白色沉淀线。当试验物质中含有一个以上的抗原、抗体系统时，由于各种抗原的扩散系数不同，各对抗原、抗体间的最适比例不同，扩散后可在不同区域形成若干条沉淀线，且可根据相邻二条沉淀线的图形是否相连或交叉，了解这两种抗原是否属于同一性质，故可利用此试验检查抗原或抗体的纯度。以及用已知抗原（或抗体）检测和分析未知的抗体（或抗原）。

　　由于血清中细菌中抗体的含量通常较低，采用一般Ouchterlony法阳性检出率较低，本试验采用改良双向扩散法，可提高反应的灵敏度近10倍，且有较高的特异性。

　　B.3 材料

　　B.3.1 被检者全血清。

　　B.3.2 已知抗原：根据检测需要选择有关的病原物抗原，如嗜热放线菌、链霉菌的可溶性抗原或从生产环境样本（如霉草堆肥）中提取的可溶性抗原物质等。

　　B.3.3 化学试剂

　　a）pH7.5 硼酸缓冲液：

　　硼酸 2.48g   NaCl6.96g  硼酸钠 0.955g

　　柠檬酸 lOg   NaOH3.5g   去离子水 1000mL

　　b）琼脂糖（电泳用）；

　　c）1%苯酚。

　　B.3.4 其他器材

　　a）70mm×60mm玻片；

　　b）外径为5mm和11mm的金属打孔器；

　　c）大号注射针头、细口吸管。

　　B.4 操作步骤

　　B.4.1 将硼酸缓冲液100mL加琼脂糖0.8g，加热融化混匀后，浇在玻璃板上，厚度2mm，每块约8.4mL。

　　B.4.2 待琼脂糖冷却后，用打孔器打成一系列孔，可呈梅花形或三角形（见图Bl）。大孔径llmm，小孔径5mm，二边距5mm用注射针头将孔中琼脂挑出，并将孔中残余琼脂用吸管吸出。打孔时应注意勿使琼脂底部与玻板间有气泡，注意封底。

　　B.4.3 在大孔中加入待测血清，小孔中加入已知抗原，约加至与孔口相平。

　　将上述双扩板水平放入含1%苯酚的湿盒内，置于室温（25）下，24～72h观察结果。需要时可进行染色观察，或晾干制成薄膜长期保存。

　　B.5 结果判定

　　抗原和抗体（血清）互相扩散，如果有白色沉淀线形成，则判定为阳性结果（见示意图）。

　　A、B表示可在一块板上测两份血清样本。

表A.1  双向扩散板打孔排列示意图

　　1～6：不同抗原编号，即一份血清可同时用6种抗原进行测定。A、B可共用1、2两号抗原。

　　测定时可根据实际需要，使用不同大小的玻板，一块板上的孔排列也可按上述的间距和孔径原则自行设计。