生物材料中锰测定法

　　B.1  尿锰测定法

　　下面介绍高碘酸钾集锰法。

　　B.1.1  原理

　　尿锰内加氨水后，使锰全部积聚于磷酸沉淀中，再用硝酸进行无机化，最后在稀硝酸溶液中用高碘酸钾将锰氧化成紫红色的高锰酸，用比色法测定。

　　B.1.2  试剂

　　a）氢氧化按（分析纯）。

　　b）硝酸（分析纯）。

　　c）1：1磷酸（分析纯）。

　　d）25%硝酸。

　　e）高碘酸钾（化学纯）。

　　f）10%硫酸钾硝酸溶液。

　　g）锰标准贮存液（1ml相当于0.1mg）。

　　h）锰标准应用液（1ml相当于0.01mg）。

　　B.1.3  操作步骤

　　a）取24小时混匀尿250ml，置于500ml锥形瓶内，加浓氨水20ml，混匀，放置过夜。

　　b）次日尽量倒去上层尿液（勿使沉淀物损失），于沉淀物中加入浓硝酸5ml，用微火加热蒸干。稍凉，加硝酸1ml，瓶口盖一5cm的表面玻璃，加热至瓶内冒浓黄烟，去盖去火。稍凉，再加硝酸1ml.覆盖后，加热至冒黄烟。去盖，待黄烟基本消失后去火。如残渣未全部转为白色，则再加硝酸1ml，继续消化，至转白为止。

　　c）残渣中加入25%硝酸5ml（亦可略加温助溶）。倾入16x110mm的试管中，再用蒸馏水2ml洗涤烧瓶，洗液一并倾入试管。

　　d）加1：1磷酸0.5ml，混匀。

　　e）加高碘酸钾0.3g，摇匀。置于沸水浴内15分钟，取出待凉，离心沉淀。

　　f）在530nm波长下，以空白管（由25%硝酸5ml，蒸馏水2ml，l：1磷酸0.5ml及高碘酸钾0.3g配成，与测定管同时煮沸15分钟）校正光密度至"0"点，读取测定管光密度读数，查阅标准曲线，求得250ml尿中锰含量，乘4，即得尿锰（mg/l）。

　　g）如不用标准曲线，则每次测定同时制备2.5ug及10ug的2个标准管及一个空白管（方法见标准曲线的绘制）。如测定管的颜色低于2.5ug，可报告小于10ug/l，如高于2.5ug，则以空白管校正光密度" 0"点，读取测定管与标准管（10ug）光密度读数后，按下式计算：

　　尿锰（mg/l）＝（标本光密度／标准管光密度）×0.01×（1.000／250）

　　B.1.4  标准曲线的绘制

　　表中各管混匀后，在沸水浴内煮沸15分钟，取出，待凉。用530nm波长，以第1管为空白管校正光密度至"0"点，读取各管之光密度读数，绘成标准曲线。

　　B.2发锰测定法

　　下面介绍甲醛肟法。

　　B.2.1  原理

　　头发有机质破坏后，锰在碱性（pH10）条件下受空气氧化，变为4价，与发中共存的铁和三聚甲醛肟共同形成络合物，用还原剂和EDTA将后者中的铁络合物分解，然后将剩余的紫红色锰络合物作比色测定。

　　B.2.2  试剂

　　a）甲醛肟试剂：称取盐酸羟胺（NH20H.HCl）8g溶于蒸馏水100ml中，加37%甲醛溶液4ml，用蒸馏水稀释至200ml.此试剂配制后可用10天。

　　b）氨缓冲液（pH=10）：将氯化铵68g溶于蒸馏水300ml，加浓氨水570ml，用蒸馏水稀释至1L。

　　c）10%抗坏血酸水溶液：（W/V）：临用时配制。

　　0.1M的EDTA溶液：依地酸钠（EDTA-2Na）3.7g溶于蒸馏水100ml。

　　d）30%过氧化氢溶液（分析纯）。

　　e）消化混合液：硝酸及过氯酸按3：2比例配制。

　　f）50%柠檬酸铵（W/V）：配制后用氨水调至pH10（用精密pH试纸测试）。50%磷酸溶液（W/V）。

　　g）锰标准溶液：精确称取干燥的高锰酸钾143.8mg，溶于蒸馏水50ml中，加浓硫酸1ml.边搅拌边滴入亚硫酸氢钠溶液，至高锰酸钾的紫红色消失为止。缓缓煮沸，使二氧化硫逸出。冷却后，移至1L容量瓶内，并准确地加蒸馏水至1L.此溶液含Mn⁺⁺50ug/ml。测试时取此液稀释成5ug/ml的锰标准应用液。

　　B.2.3  操作步骤

　　a）发样经5%洗涤剂浸泡后，用水冲洗5～6次，再用去离子水洗3～4次，在105℃的烘箱内烘干。

　　b）将处理好的发样剪成4-5mm左右备用。称取发样0.5g置于100毫升锥形瓶中，加消化混合酸 5ml及玻璃珠2粒，在电炉上缓缓加热，保持微沸，至瓶中冒浓的白烟时取下，加入30%过氧化氢溶液 1ml，此时产生黄绿色气体，继续加热至透明状态（如果在冒烟时溶液还不够透明，可再加过氧化氢数滴），并蒸发至干。取下锥形瓶，冷却后沿瓶壁加去离子水3ml，冲洗瓶壁上残留的过氯酸，再加热蒸干，至过氯酸被完全赶掉。

　　c）冷却后，沿瓶壁滴人去离子水5.7ml，溶解残渣，加50%磷酸2滴，50f柠檬酸铵1ml，混匀。加入甲醛肟试剂与氨缓冲液各1ml，充分搅拌，放置5分钟使其完全显色。

　　d）加入10%抗坏血酸溶液0.3ml及0.1M的EDTA溶液1ml，充分混合，放置15分钟，使铁络合物分解。将溶液倒入比色杯，以空白试剂作参比，于450nm波长测其光密度，查阅标准曲线，求出发锰的浓度。

　　B.2.4  标准曲线的绘制

　　分别取锰标准应用液0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0ug置于10ml出色管内，加水至5ml，加入50%磷酸2滴，50%柠檬酸铵1ml，混匀。以下操作步骤同B.2.3，最后加水至出色管10ml刻度处。将以上各管的比色结果绘制成标准曲线。有色溶液的光密度在1小时内保持不变。

　　B.3  生物材料中合锰量的增高，须经多次（3次以上）检查方能确定。其数值以本地区正常值为标准进行判定。