室间隔interventricular septum位于左、右心室之间，也成45°斜位。室间隔可分为肌部和膜部。肌部构成室间隔的绝大部分，膜部为位于室间隔后上部约1.5-2.0厘米直径的卵圆区，由两层心内膜及其间的结缔组织构成，缺乏肌纤维，厚约1毫米。膜部的右侧面被三尖瓣的隔侧瓣附着缘分上、下两部。上部分隔右心房和左心室，因此该部又称房室隔。下部分隔左、右心室。室间隔膜部的成因是由于胚胎时期左、右心室相通，在发育过程中室间隔自下向上生长，上缘留有室间孔，隆生前室间封闭，形成室间隔膜部，而将左、右心室完全分隔。如发育受阻，则形成室间隔缺损。
