当反应速度为最大速度一半时，米氏方程可以变换如下：
Vmax=Vmax[S]／Km+[S]
进一步整理可得到：
Km=[S]
可知，Km值等于酶反应速度为最大速度一半时的底物浓度。
因为Km=K2+K3／K1，当K2》K3，即ES解离成E和S的速度大大超过分离成E和P的速度时，K3可以忽略不计，此时Km值近似于ES解离常数KS，此时Km值可用来表示酶对底物的亲和力。
Km=K2/K1=[E][S]/［ES］=KS
Km值愈大，酶与底物的亲和力愈小；Km值愈小，酶与底物亲和力愈大。酶与底物亲和力大，表示不需要很高的底物浓度，便可容易地达到最大反应速度。但是KS值并非在所有酶促反应中都远小于K2，所以Ks值（又称酶促反应的底物常数）和Km值的涵义不同，不能互相代替使用。
Km值是酶的特征性常数，只与酶的性质，酶所催化的底物和酶促反应条件（如温度、pH、有无抑制剂等）有关，与酶的浓度无关。酶的种类不同，Km值不同，同一种酶与不同底物作用时，Km值也不同。各种酶的Km值范围很广，大致在10-1～10-6M之间。
当K3不远远小于K2和K1时，Km表示整个反应的化学平衡的常数。
如果Km值已知，任何底物浓度时酶的饱和度（形成中间产物的酶占总酶的比例，saturation fraction fEs）fEs便可计算出来。
fES=［ES］／［Et］=K3［ES］／K3［Et］＝V／Vmax=[S]／Km+[S]
