脂酰CoA进入线粒体基质后，在脂肪酸β氧化酶系催化下，进行脱氢、加水，再脱氢及硫解4步连续反应，最后使脂酰基断裂生成一分子乙酰CoA和一分子比原来少了两个碳原子的脂酰CoA. 因反应均在脂酰CoA烃链的α，β碳原子间进行，最后β碳被氧化成酰基，故称为β氧化。

　　a　脱氢：脂酰CoA在脂酰基CoA脱氢酶的催化下，其烃链的α、β位碳上各脱去一个氢原子，生成α、β烯脂酰CoA（trans-y-enoyl CoA），脱下的两个氢原子由该酶的辅酶FAD接受生成FAD.2H.后者经电子传递链传递给氧而生成水，同时伴有两分子ATP的生成。

　　b　加水：α、β烯脂酰CoA在烯酰CoA水合酶的催化下，加水生成β-羟脂酰CoA（βhydroxy acylCoA）。

　　c　再脱氢：β-羟脂酰CoA在β-羟脂酰CoA脱氢酶（L-βhydroxy acyl CoAdehydrogenase）催化下，脱去β碳上的2个氢原子生成β-酮脂酰CoA，脱下的氢由该酶的辅酶NAD+接受，生成NADH＋H+ .后者经电子传递链氧化生成水及3分子ATP.

　　d　硫解：β-酮脂酰CoA在β-酮脂酰CoA在硫解酶（β-ketoacylCoA thiolase）催化下，加一分子CoA SH使碳链断裂，产生乙酰CoA和一个比原来少两个碳原子的脂酰CoA.以上4步反应均可逆行，但全过程趋向分解，尚无明确的调控位点。