登革热诊断标准及处理原则附录A：登革热血清学检测方法

A1 应用IgM捕捉ELISA法检测DFIgM抗体

AI.1原理

根据抗原抗体特异性结合的原理，利用抗人谬链单克隆抗体捕获待检测血清中的IgM，再加入特异性抗原和相应酶标单克隆抗体，加底物显色。显色程度与特异性IgM抗体含量呈正相关，以待检血清与特异性抗原和阴性血清（对照）与抗原反应光密度（0D）值的比值，作为判定IgM抗体反应的标准。

A1.2材料

A1.2.1 96孔聚苯乙烯U型塑料板、酶标仪。

A1.2.2 10～100μL可调加样器1支、10 mL吸管若干。

A1.2.3抗人IgM（μ链）单克隆抗体。

A1.2.4抗原

a） Cs/36细胞培养的各型DV为阳性抗原。

b）未接种病毒的正常CJ36细胞为阴性抗原对照。

（抗原制备：病毒接种CJ36细胞，病变达“+++”，冻融3次，用波长14～22 kHz超声波粉碎3次，每次30 s.3 000 r/min离心15 min，上清即为抗原。

A1.2.5抗IgM阴性或阳性对照血清

A1.2.6辣根过氧化物酶标化DVI～4型单克隆抗体。

A1.2.7缓冲液

a.洗液：O.05%吐温-20 pH7.4PBS

b.稀释液：10%牛血清 pH7.4PBS

c.封闭液：1%牛血清白蛋白 pH9.6碳酸缓冲液

A1.2.8底物：邻苯二胺溶液（pH5.O磷酸盐柠檬酸盐缓冲液100mL，邻苯二胺40 mg，30%过氧化氢溶液0.15 mL，临用前按需配制，立即使用）。

A1.2.9终止液：1 mol/L硫酸。

A1.3检测方法

A1.3.1用稀释液按效价稀释抗人μ链，每孔加0.1 mL，加盖，4℃过夜。

A1.3.2弃去抗人μ链。用洗涤液重复洗3次，甩干，加封闭液，每孔0.1mL，37℃水浴2h.

A1.3.3弃封闭液。用洗涤液重复洗涤3次，甩干，加1：10待检血清，每标本加10孔，每孔0.1 mL，37℃水浴2h.

A1.3.4弃血清，用洗涤液重复洗涤3次，甩干，分别加4个型DV抗原及阴性抗原对照，按顺序各加2孔至每份待检血清的10个孔中，每孔0.1mL，4℃过夜。

A1.3.5弃抗原，用洗涤液重复洗涤3次，甩干，加用稀释液稀释至工作浓度的相应的DF酶标单克隆抗体，正常抗原加四个型混合的酶标单克隆抗体，每孔0.1mL，37℃水浴2h.

A1.3.6去标记物，用洗涤液重复洗涤3次，甩干，每孔加入新鲜配制的底物液0.1mL，37℃水浴30 min，显色。

A1.3.7每孔加1 mol/L硫酸溶液0.05mL，终止反应。

A1.4结果判断

A1.4.1 酶标检测仪测定OD值（空向对照调零），见式（A1）。

k=（OD₁-OD₀）/（OD₂-OD₀）……………………………………（A1）

式中：OD₁——血清与病毒抗原反应的OD值；

OD₀——空白孔的OD值；

OD₂——血清与正常抗原反应的OD值。

K≥2.1判为阳性。

A1.4.2目测法。阳性抗原孔呈淡黄色，桔黄色或浅棕黄色，阴性抗原基本无色。

A1.5意义

IgM抗体阳性，表示患者新近感染DV，适用于DF早期诊断。

A2血凝抑制（HI）试验检测DF血凝抑制抗体

A2.1原理

DV有血凝索抗原，在适宜的pH条件下能凝集鹅、鸡及绵羊红细胞，引起红细胞凝集现象。这种现象能被加入的特异抗体所抑制，称之为血凝抑制试验（HI）。可用于血凝抑制抗体的测定。

A2.2材料

A2.2.1 U型塑料板（96孔）。

A2.2.2 10～100 μL、100～1 000 μL可调加样器、10 mL吸管。

A2.2.3 1～4型DV鼠脑蔗糖丙酮抗原或DV C6/36细胞抗原，抗原与同型抗体滴度应大于与异型抗体交叉反应2个滴度以上。

A2.2.4稀释液，pH6.4磷酸缓冲液，用于稀释鹅血球。

pH9.O硼酸缓冲盐水，用于稀释血凝素和血清。

A2.2.5鹅血球：于鹅翅下静脉抽血，置于血球保存液混匀，用生理盐水洗3次，最后以2 000 r/min离心15 min医|学教育网整理，弃去上清，用pH6.4PBS稀释至0.5%鹅血球悬液，4℃保存备用。

A2.2.6待检血清处理：用生理盐水把血清稀释成1： 10，置56℃水浴灭活30 min.用10倍蚤4℃丙酮处理2次，离心去上清，沉淀物真空干燥，加入pH9.O硼酸缓冲盐水恢复到l：10浓度。4℃过夜。然后每管加入50%鹅血球0. 05 mL，37℃水浴30 min.离心沉淀取上清，即为1： 10处理血清。阴、阳性对照血清同方法处理。

A2.3检测步骤

A2.3.1血凝素滴定

在塑料板上，每孔加pH9.0硼酸缓冲盐水25 μL.各取1～4型DV抗原25 μL各置于第1孔，作倍比稀释，最后一孔混匀后弃25 μL.然后于每孔补加pH9.O稀释液25 μL，各加0.5%鹅血球50 μL混匀，置于37℃水浴作用2h，结果以最高稀释度出现“++”为1个血凝单位，正式试验用4个单位。

A2.3.2血凝抑制试验

在塑料板中，除第1孔外，于各孔加入pH9.0硼酸缓冲盐水25 μL.第1、2孔和第8孔分别加入25μL巳处理待检血清，从第2孔开始，作倍比稀释，最后一孔不稀释，补加pH9.O硼酸缓冲盐水25 μL.然后按顺序予第1排至第4排各分别加入DV1～4型4个单位的血凝抗原25 μL.最后一孔不加抗原。混匀，放37℃水浴2h，再于每孔加0.5%鹅血球50μL，混匀，37℃水浴2h，观察结果。

A2.4结果判断

以完全抑制鹅血球凝集的血清最高稀释度倒数为血凝抑制抗体效价。

A2.5意义

恢复期血清滴度比急性期血清滴度有4倍增高可确诊。

A3补体结合（CF）试验

A3.1原理

补体有结合抗原-抗体复合物的特性。病毒抗原与特异性抗体（试验材料）形成复合物时，加入一定量补体。则补体与之结合，不再以游离的形式存在，此时，加入另一对抗原，抗体（羊血球溶血索），由于后者没有游离的补体参与反应，结果不溶血，表示补体已结合于抗原-抗体复合物中，称为阳性，如试验材料中没有病毒抗原一抗体复合物，则加入的定盘补体仍以游离的形式存在，与再加入的羊血球溶血索反应而显溶血，此为阴性。

A3.2材料及方法

（略）

A3.3意义

单份血清抗体滴度达1：32，对诊断登革热有参考意义，恢复期血清比急性期血清抗体滴度有4倍抗体增长可确诊。

A4用免疫荧光法（FA/IFA）检测双份血清IgG抗体

A4.1原理

某些荧光索（常用异硫氰酸荧光素）能与抗体蛋白分子结合，而不丧失抗体活力，仍能和相应的抗原发生特异免疫反应，产生免疫复合物，这种复合物由于有荧光色素的参与，在荧光显微镜下显示荧光，表明有特异性抗原存在。直接免疫荧光法可用于检测感染细胞内的特异性抗原，间接免疫荧光法可查待检血清中的特异性抗体。

A4.2材料

A4.2.1 10～100 μL，100～1 000 μL可调移液器各1支。

A4.2.2 DV1～4型抗原片（登革标准毒株感染Cs/36细胞制备，低温干燥保存）及相应单克隆抗体（阳性对照）、阴性血清。

A4.2.3羊抗人（兔抗人）IgG荧光抗体。

A4.2.4待检患者血清（急性期和恢复期）。

A4.2.5常用稀释液。pH7.2～7.4PBS、伊文斯兰、封片胶等。

A4.2.6荧光显微镜。

A4.3检测步骤

A4.3.1取出抗原片，冷风吹干。

A4.3.2用pH7.2～7.4PBS稀释待检血清，从1：20开始，倍比稀释至所需稀释度。

A4.3.3用加样器依次从商稀释度向低稀释度逐个加入稀释的待检血清于四个型的DV抗原片孔中，每型各加2孔待检系列稀释血清，血清最以完全覆盖抗原面而不溢出孔外为准，置湿盒内，在37℃水浴孵育30 min（每次试验同时作阴、阳性对照）。

A4.3.4用pH7.2～7. 4PBS洗涤3次，每次约30 s至1 min，再用蒸馏水洗1次，冷风吹干。

A4.3.5用pHT.2～7.4PBS稀释荧光抗体。使其内含2个工作单位和1 ：8 000伊文斯兰的荧光抗体，加入各孔中。使完全覆盖抗原面-置湿盒中，37℃水浴作用30 min.取出，如A4.3.4洗涤及吹干。

A4.3.6用封片胶（或甘油缓冲液）封片，荧光显微镜观察结果。

A4.4结果判断

特异性荧光呈黄绿色颗粒，分布在感染细胞浆中。根据荧光亮度和阳性细胞在细胞总数中所占的比例可将荧光反应大致区分为“+～++++”，无荧光者为“-”，检测抗体滴度时，以特异荧光达“++”最高血清稀释度的倒数表示。

A4.5意义

阳性结果，表明提供血清的个体曾受到DV感染，大于1：80有诊断参考意义医|学教育网整理。恢复期抗体滴度比急性期抗体滴度有4倍或以上升高则可确诊。

A5免疫斑点（dengue blot）试验检测DV-IgG抗体

A5.1原理

根据抗原抗体特异性结合的原理，把抗原固定于硝酸纤维索膜载体，与待测血清的特异性抗体结合成抗原抗体复合物，再与酶标记物结合，通过酶与底物作用产生颜色，表示阳性，阴性不显色。

A5.2材料及方法

（略）。

A5.5意义

阳性结果可作为DV感染参考。早期血清“-”，恢复期血清“+”确诊DV感染。

A6 中和试验（NT）

A6.1原理

使用对病毒敏感的动物、细胞或鸡胚为材料，测定病毒受免疫血清中和残存感染力与对照试验组比较，计算出中和指数。

A6.2材料和方法

（略）

A6.3意义

中和指数在9以下为阴性，10～49为可疑，50以上为阳性。用于鉴定病毒和疾病诊断。