硫酸庆大霉素对大肠杆菌、产气杆菌、克雷白杆菌、奇异变形杆菌、某些吲哚阳性变形杆菌、绿脓杆菌、某些奈瑟菌、某些无色素沙雷杆菌和志贺菌等革兰阴性菌有抗菌作用。革兰阳性菌中，金黄色葡萄球菌（包括产β-内酰胺酶株）对本品敏感；链球菌（包括化脓性链球菌、肺炎球菌、粪链球菌等）均对本品耐药。厌氧菌（拟杆菌属）、结核杆菌、立克次体、病毒和真菌亦对本品耐药。
近年来，由于本品的广泛应用，耐药菌株逐渐增多，绿脓杆菌、克雷白杆菌、沙雷杆菌和吲哚阳性变形杆菌对本品的耐药率甚高。本品主要作用于革兰阴性需氧杆菌，医学教育网搜|索整理包括肠杆菌（如大肠杆菌、克雷白菌、变形杆菌、沙雷菌、沙门菌等）、绿脓杆菌等；对金葡菌亦有效。本品对多数细菌的作用与妥拉霉素（tobramycin）相似，对沙雷菌的作用强于妥拉霉素，对绿脓杆菌则逊之。院内感染时肠杆菌和绿脓杆菌中许多细菌对本品耐药而对阿米卡星（amikacin）敏感。
