肉毒中毒可能与Guillain-Barré综合征，脊髓灰质炎，脑卒中，重症肌无力，蜱媒性麻痹以及由箭毒或颠茄生物碱引起的中毒混淆。肌电图的检查对诊断是有帮助的，因为在大多数患者中能产生对快速重复性刺激的特征性增强反应。
在食物源型肉毒中毒中，神经肌肉失调的类型以及摄入可疑食物可为诊断提供重要线索。同时有2例或更多的患者在摄入同一食物后发病可以简化诊断，确诊需要在患者的血清或粪便中找到肉毒毒素，或从粪便中分离到该菌。在可疑食物中找到肉毒毒素可确定其为传染源。家中宠物摄入相同的污染食物后也可能发生肉毒中毒。
对创伤型肉毒中毒，在血清中找到毒素或从伤口处分离并在厌氧条件下培养出肉毒杆菌可明确诊断。
婴儿型肉毒中毒需与脓毒症，先天性肌营养不良，脊柱肌肉萎缩，甲状腺功能减退及良性先天性肌张力减低相鉴别。在粪便中找到肉毒毒素或该菌可确诊。
