本病不能单凭病史和临床表现作出诊断。胸部X线检查、电子计算机体层照相术有诊断价值。血清学试验阳性对诊断有帮助。对菌丝型抗原测定为1∶4和对酵母型抗原为1∶16，是疾病活动的有力证据。组织胞浆菌素皮内试验阳性表示过去或现在有感染，适用于普查。琼脂凝胶双相扩散试验比补体结合试验更具有特异性，但与芽生菌和球孢子菌病有交叉反应，因此必须同时作组织胞浆菌素、芽生菌素及球孢子菌素皮肤试验，以便鉴别。
痰、尿、血、骨髓、胸水及其他分泌物涂片或培养分离出荚膜组织胞浆菌，或病理组织切片发现酵母型真菌，可以确诊。纤支镜活检和灌洗物培养有确诊价值，更适用于未钙化结节病灶和空洞型病变。浅表淋巴结活检，肝、脾、肺等穿刺活检对确诊很重要，但内脏穿刺宜慎重。
