【摘要】  目的：探讨不同剂量的辛伐他汀处理裸鼠体内K562细胞的信号通路的分子变化，以说明辛伐他汀诱导K562细胞凋亡的分子机制。 方法：体外培养K562细胞并经皮下接种Balb/cnu/nu裸小鼠K562细胞，构建裸小鼠的K562细胞动物模型。 采用缺口末端标记技术TUNEL法检测辛伐他汀诱导K562细胞早期凋亡的变化。 采用RTPCR检测K562细胞中Ras分子和PI3KAKT信号通路的nras， pi3k， akt1， nfκb1 mRNA的差异表达。 结果： 不同剂量的辛伐他汀能够诱导裸鼠体内K562细胞凋亡，并随剂量的增加凋亡率逐渐增高（P<0.01）；不同剂量的辛伐他汀能够引起nras， pi3k， akt1， nfκb1 mRNA的表达差异（P<0.01）。 结论： 辛伐他汀能够引起参与K562细胞凋亡的Ras 分子和PI3KAKT信号通路的基因变化，从一定的角度说明辛伐他汀在体内能够诱导K562细胞凋亡。

　　【关键词】  辛伐他汀；K562细胞；裸鼠；凋亡

　　0引言

　　慢性粒细胞白血病（CML）融合基因bcr/abl编码产物P210bcr/abl可激活Ras， PI3K， STATs等多条信号途径。 辛伐他汀对慢性粒细胞白血病细胞的作用机制多限于体外研究，有必要观察和探讨其在实验动物体内的效果和作用机理。 而且，p21ras和PI3K的上游激活可启动BcrAbl诱导的转化，其下游靶标仍未完全清楚［1］。 我们用辛伐他汀作用裸鼠体内K562细胞，检测它对裸鼠体内K562细胞的影响，以说明辛伐他汀是否通过引起裸鼠体内K562细胞中Ras分子和Ras下游的PI3KAKT信号通路的分子水平的变化来诱导K562细胞凋亡的发生。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　12只健康裸鼠，雌性，4+周龄，购自四川大学华西医学中心，并饲养于SPF标准的实验室。 辛伐他汀购自中国药品生物制品检定所，以无水乙醇溶解后，再加入与辛伐他汀等摩尔的NaOH，50℃水浴2 h，调整pH值至7.20，过滤除菌，调节浓度至0.2 g/L备用。 噻唑蓝、二甲亚砜购自Sigma公司，培养基和胎牛血清购自Gibco公司，TUNEL试剂盒为美国Roche公司产品。 Trizol 和逆转录试剂Rever TraAce购自Bioflux公司，扩增的基因引物由英骏生物技术有限公司合成，PCR试剂由北京天为时代科技有限公司提供。

　　1.2方法

　　1.2.1细胞培养

　　K562细胞购自四川大学华西医学中心，以含100 mL/L灭活小牛血清，100万U/L青霉素，80万U/L链霉素的RPMI 1640培养液于37℃， 5 mL/L CO2培养箱中培养。

　　1.2.2慢性粒细胞白血病动物模型的构建

　　取对数生长期的K562细胞用PBS洗涤2次，调整至5×1010/L，于裸鼠右前腋下皮下注射0.4 mL，待接种K562细胞的3只裸鼠身上的肿瘤组织长到2 cm3左右时，处死裸鼠。 取肿瘤组织均匀地分成体积相当的小块组织进行另外12只裸鼠的皮下移植。 待皮下移植的肿瘤组织长到0.5 cm3左右时，将12只裸鼠随机分成3组，对照组4只，腹腔注射生理盐水0.2 mL，处理组分成2个剂量组，各4只，T1组注射0.2 g/L的辛伐他汀0.25 mL，T2组注射0.2 g/L的辛伐他汀0.4 mL. 对照组和处理组隔日分别注射生理盐水和辛伐他汀，连续6次。

　　1.2.3原位末端转移酶标记法（TUNEL）

　　检测肿瘤组织细胞早期凋亡按原位凋亡基因检测试剂盒说明书的步骤进行操作，检测细胞凋亡。 同时设立阴性对照和阳性对照，阴性对照不加Tunel混合液，阳性对照加DNase.

　　1.2.4RTPCR检测

　　RTPCR检测nras， pi3k， akt1， nfκb1 mRNA的差异表达。 取质量相等的肿瘤组织进行冰上匀浆，按照总RNA提取试剂说明书， 加入1 mL Trizol提取总RNA，紫外分光光仪定量。 RNA逆转录合成cDNA，逆转录体系40 μL，其中总RNA 2 μg， 42℃水浴50 min，然后进行PCR扩增。 各基因的正义和反义引物序列分别是nras： F 5′>3′ TACATCGAGACCTCGGCCAA， R 3′>5′ CGTTCACACACGAGAGGACT，产物150 bp； pi3k： F 5′>3′ AACTCTGGGGATGACCTGGA，R 3′>5′ AGGCGGTCACA ACACTCCTA，产物300 bp； akt1 F 5′>3′ AGGGTTGGCTGCACAAACGA， R 3′>5′  GTTGTTGA AGAGACACCGCG，产物150 bp； nfκb1： F 5′>3′ TGAAGTGAT CCAGGCAGCCT，R 3′>5′ CACCTCTGTAGGAAGGCGTT，产物150 bp. pi3k， akt1， nfκb1的内参GAPDH1：    5′>3′ACCACAGTCCATGCCATCAC， 3′>5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA；产物450 bp；nras的内参GAPDH2：5′>3′GGCCTCCAAGGAGTAAGACC，3′>5′ AGGGGTCTACAT GGCAACTG，产物147 bp.

　　PCR反应体系为：总体积25 μL， cDNA 3 μL，上下游引物各1 μL， 2×master mix 12.5 μL，用ddH2O补足至25 μL. 扩增条件为：94℃ 5 min， 94℃ 1 min， 59℃ 1 min， 72℃ 1 min， 30个循环；72℃ 10 min， 4℃ 30 min. 取10 μL目的基因扩增产物和4 μL GAPDH扩增产物进行25 g/L琼脂糖凝胶电泳。

　　统计学处理：用Quantity One软件分析基因的表达，组间均数比较采用SPSS10.0软件进行单因素方差分析以及LSDt检验。

　　2结果

　　2.1辛伐他汀能诱导肿瘤组织细胞凋亡

　　凋亡细胞判断及评价标准：根据凋亡细胞呈散在分布，细胞核被染成红色形态符合凋亡特征，用Image pro Plus5.0分析免疫组化结果，结果采用SPSS10.0软件进行单因素方差分析。 对照组的凋亡指数为0.20±0.01，T1组的凋亡指数为0.50±0.02，T2组的凋亡指数为0.71±0.04， 三组比较有统计学差异（P=0.001， 图1）。

　　2.2辛伐他汀能够诱导CML肿瘤组织细胞nras， pi3k， akt1， nfκb1 mRNA的差异表达各基因的RTPCR结果有一定差异（图2）。

　　随着辛伐他汀剂量的加大，K562细胞中nras mRNA明显表达下调，对照组与处理组之间的nras mRNA差异表达有统计学意义（P≈0.000），处理组本身之间的nras mRNA差异表达也有统计学意义（P=0.002）。 pi3k mRNA在对照组与处理组之间表达差异有统计学意义（P≈0.000），pi3k mRNA在对照组与T1， T2组的差异表达分别都具有统计学意义（P≈0.000）。 处理组本身之间pi3k mRNA的差异表达有统计学意义（P≈0.000）。 akt1 mRNA在对照组与处理组之间也有统计学意义（P≈0.000），对照组与T1，T2组的差异表达分别都具有统计学意义（P≈0.000），处理组本身之间akt1 mRNA的差异表达有统计学意义（P≈0.000）。 对照组与处理组之间的nfκb1 mRNA的差异表达有统计学意义（P≈0.000），对照组与T1，T2组nfκb1 mRNA的差异表达分别都具有统计学意义（P≈0.000）。

　　3讨论

　　慢性粒细胞白血病细胞中的Ras癌基因编码的21 kd的G蛋白在信号通路转导、增殖、分化和恶性转移中有重要作用［2-3］。 Ras蛋白要发生异戊二烯化等翻译后修饰才能与细胞膜结合和具有完整的生物学活性。 MAPK/ERK通路上的包括Ras在内的癌基因和抑癌基因在20％～30％的人类肿瘤中可发现经常性的基因突变。 基于人类肿瘤Ras突变的频繁性比其他基因高，开发MAPK/ERK抑制剂这类抗肿瘤药物是颇具希望的药理学策略。 其中一个策略就是体内阻断癌基因Ras的功能，来抑制Ras的转录后的翻译后修饰［3］。 我们研究发现，辛伐他汀注射裸鼠后能引起CML组织的K562细胞nras mRNA的表达差异，nras mRNA随辛伐他汀剂量加大明显下调。研究表明K562细胞BcrAbl能够依赖PI3K激活下游分子的方式模拟IL3刺激细胞增殖［4］。 此外，AKT还可直接作用于凋亡信号如Bad和转录因子forkhead家族或间接调控P53和NFκB对细胞凋亡进行调节。 因此，AKT是肿瘤治疗的一个重要靶点。 而我们的研究表明，辛伐他汀在体内作用CML组织的K562细胞后能够诱pi3k和akt1 mRNA的表达上调，同时抑制PI3K/AKT通路下游的nfκb1的表达。

　　PI3K/AKT通路作为一条与细胞增殖密切相关的信号途径可受Ras癌蛋白和IL3等多种因素的激活，本实验中pi3k和akt1 mRNA水平的表达上调可能受到K562细胞中的BcrAbl融和蛋白的激活而被诱导表达上调。 转录因子NFκB是MEK/MAPK通路下游的一个靶标，虽然NFκB的激活与许多凋亡活动的发生有关［5］，但它能阻断许多刺激引起的凋亡效应，包括化疗药物。 NFκB的抗凋亡效应来自其对凋亡抑制剂的诱导。 NFκB是细胞信号传导通路中的重要环节，也是预防癌症以及增强化疗敏感性的一个理想的治疗靶位点［6］。 我们的研究表明，辛伐他汀能够引起NFκB通路nfκb1的表达下调，说明辛伐他汀在体内可能通过引起NFκB通路中的nfκb1的表达下调参与CML组织K562细胞凋亡的发生。

　　【参考文献】［1］Ying Lu， Lee Jamieson， Allan R Brasier， et al. NFкB/RelA transactivation is required for atypical protein kinase Cl mediated cell survival［J］。 Oncegene， 2001，20（35）：4777-4792.

　　［2］Reuther GW， Der CJ. The Ras branch of small GTPases： Ras family members dont fall far from the tree［J］。 Curr Opin Cell Biol， 2000， 12（2）：157-165.

　　［3］Reuter CW， Morgan MA， Bergmann L. Targeting the Ras signaling pathway： A rational， mechanismbased treatment for hematological malignancies［J］。 Blood，2000，96（5）：1655-1669.

　　［4］Deininger MW， Goldman JM， Melo JV.The molecular biology of chronic myeloid leukemia［J］。 Blood，2000， 96（10）：3343-3356.

　　［5］Kaltschmidt B， Kaltschmidt C， Hofmann TG， et al. The pro or antiapoptotic function of NFkappaB is determined by the nature of the apoptotic stimulus［J］。 Eur J Biochem， 2000， 67（12）：3828-3835.

　　［6］Bharti AC， Aggarwal BB. Nuclear factorkappa B and cancer： Its role in prevention and therapy［J］。 Biochem Pharmacol， 2002， 64（56）：883-888.