【关键词】  内质网； 衣霉素； 葡萄糖调节蛋白78； 凋亡促进因子CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白； 小鼠

　　内质网（endoplasmic reticulum， ER）广泛存在于真核细胞中，是蛋白质合成、折叠、运输以及细胞内钙离子储存的主要场所。内质网中钙离子紊乱和未折叠蛋白质蓄积可引发内质网应激（endoplasmic reticulum stress， ERS），发生具有保护作用的未折叠蛋白反应（unfolded protein response， UPR）。内质网应激直接影响应激细胞的转归，如修复、损伤或凋亡。神经系统许多疾病与内质网应激相关。最近的研究表明，内质网应激介导的凋亡信号传导途径可能与阿尔茨海默病（Alzheimer disease， AD）的发病有关。本研究观察滋补脾阴方药（Zibu Piyin Recipe， ZBPYR）含药血清对由N糖链抑制剂衣霉素（tunicamycin， Tm）引起的内质网应激的影响，以探讨其神经保护机制。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验药物  滋补脾阴方药由清代吴澄《不居集》中资成汤加味而成，由红参30 g，山药15 g，茯苓15 g，白芍15 g，丹参12 g，白扁豆15 g，莲肉20 g，石菖蒲10 g，远志10 g，檀香4.5 g，橘红9 g，甘草9 g组成，均购自大连医药集团药材公司。中药常规水煎，每毫升中药液含生药3.29 g，4 ℃保存备用。

　　1.2  主要试剂和仪器  达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbecco‘s modified eagle’s medium， DMEM）和胎牛血清，Gibco公司产品；胰蛋白酶和TRIReagent，Sigma公司产品；Tm，星形孢菌素（staurosporine， STS），日本Wako公司产品；细胞毒性检测试剂盒，Roche公司产品；RNase OUT和Oligo （dt），Invitrogen公司产品。二氧化碳恒温培养箱，Thermo Forma公司产品；台式高速冷冻离心机，Sigma公司产品；UV754紫外分光光度计，上海分析仪器总厂产品；温度梯度PCR扩增仪，Thermo Hybaid公司产品；酶标仪，美国BIOTEKTM公司产品；凝胶成像分析系统，UVP公司产品。

　　1.3  中药血清制备  取健康雄性SD大鼠（220～250 ｇ）12只，随机分为对照组和ZBPYR组，每组6只。适应饲养3 d后，ZBPYR组给予滋补脾阴方药灌胃，10 ml/kg体质量，此剂量灌胃2次/d，连续3 d；对照组给予等体积生理盐水灌胃。于末次给药后1 h腹主动脉取血，静置2 h，2 000 r/min，4 ℃离心15 min分离血清，离心半径为16.1 cm，56 ℃，30 min灭活。0.22 μm滤膜过滤除菌，－20℃保存备用。

　　1.4  Neuro2a细胞的培养  小鼠神经瘤母细胞Neuro2a细胞株由日本北海道大学药学部野村靖幸教授惠赠。细胞常规复苏后加入培养液于5% CO2、37 ℃培养箱培养。细胞单层长满后用终浓度为0.25%胰蛋白酶37 ℃条件下消化3 min，以1∶3传代。培养液含90% DMEM、10%胎牛血清和1％双抗。细胞长至第三代可以使用。

　　1.5  乳酸脱氢酶释放试验  Neuro2a细胞接种后分为对照组、10％空白血清组、5％ZBPYR组、10％ZBPYR组、15％ZBPYR组、Tm（5 μg/ml）组、10％空白血清＋Tm（5 μg/ml）组、5％ ZBPYR＋Tm（5 μg/ml）组、10％ ZBPYR＋Tm（5 μg/ml）组、15％ ZBPYR＋Tm（5 μg/ml）组。细胞单层长至70％时按以上分组给予相应刺激。刺激后细胞放入5％CO2、37℃培养箱继续培养48 h后用乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase， LDH）释放试验检测LDH泄漏率。LDH实验步骤按试剂盒说明执行。LDH泄漏率为细胞上清中LDH活性与细胞总的LDH活性比值。LDH活性测定用酶标仪于490 nm处检测。另外Neuro2a细胞接种后分为对照组、STS（0.1 μmol/L）组、10％空白血清＋STS（0.1 μmol/L）组、15％ ZBPYR＋STS（0.1 μmol/L）组，待细胞单层长至70％时按以上分组给予相应刺激。刺激后细胞放入5％ CO2、37 ℃培养箱继续培养48 h后检测LDH泄漏率。

　　1.6  逆转录聚合酶链式反应  实验分组同前。细胞单层长至90％时按以上分组给予相应刺激。细胞放入5％ CO2、37 ℃培养箱继续培养6 h.总RNA的提取和逆转录聚合酶链式反应。（1）收集细胞用TRIReagent提取总RNA.用紫外分光光度计测定A260/A280，计算RNA浓度。（2）逆转录反应。反应体系为20 μl.取2 μg总RNA，加二乙基焦磷酰胺（diethyl pyrocarbonate， DEPC）水至总体积为9 μl，加0.5 μl Oligo （dt） 1218引物混合后，置70 ℃变性10 min.然后加入下列成分：5×第一链缓冲液5.875 μl、10 mmol/L dNTP 2 μl、0.1 mol/L DTT 2 μl、RNase抑制剂0.5 μl和逆转录酶0.125 μl，混合使反应总体系为20 μl.放入46 ℃反应1.5 h，70 ℃变性15 min，冰上5 min后进行扩增。（3）PCR反应。在0.2 ml PCR管中加入1.2  μl逆转录产物、sd H2O 9 μl、10 mmol/L dNTP 0.24 μl、10×PCR缓冲液1.2 μl、聚合酶0.12 μl、上游引物（20 μmol/L）0.12 μl、下游引物（20 μmol/L）0.12 μl，总反应体系为12 μl.（4）PCR产物观察。PCR产物经40％丙烯酰胺凝胶电泳后，EB染色15 min，用凝胶成像系统进行拍照及图像分析，然后计算待测基因与内标磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase， GAPDH）吸光度的比值。PCR反应扩增参数如下：葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein 78， GRP78），94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循环22圈，72 ℃ 5 min；凋亡促进因子CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CCAAT/EBP homologous protein， CHOP），94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循环25圈，72 ℃ 5 min；GAPDH，94 ℃ 5 min，94 ℃ 40 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，循环28圈，72 ℃ 5 min.引物序列见表1.

　　表1  引物序列（略）

　　Table 1  Sequence of the primers

　　1.7  统计学方法  每组实验重复4次，图像分析采用LabWorks 4.6专业图像分析软件。数据用SPSS 13.0软件进行分析，两组间差异比较采用t检验。

　　2  结果

　　2.1  LDH释放试验检测ZBPYR含药血清对Tm刺激Neuro2a后LDH泄漏率的影响  各浓度含药血清和10%空白血清组与对照组相比，LDH泄漏率差异没有统计学意义，说明血清对Neuro2a细胞没有毒性作用；Tm（5 μg/ml）组与对照组相比，LDH泄漏率明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；10％空白血清预处理组LDH泄漏率与Tm组相比，差异无统计学意义；而各浓度ZBPYR含药血清预处理组与Tm组相比，LDH泄漏率下降明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。10％药物血清预处理组与10％空白血清预处理组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1.

　　2.2  RTPCR方法观察ZBPYR含药血清对Tm刺激Neuro2a后GRP78 mRNA表达的影响  各浓度含药血清和10%空白血清组与对照组相比，GRP78 mRNA表达差异无统计学意义，说明血清对Neuro2a细胞GRP78 mRNA表达没有影响；Tm（5 μg/ml）组与对照组相比，GRP78 mRNA表达明显增强（P＜0.05）；而加入血清预处理1 h后再加入浓度为5 μg/ml Tm各组与Tm（5 μg/ml）组相比，GRP78 mRNA表达明显下降（P＜0.05），其中ZBPYR含药血清预处理组GRP78 mRNA表达较空白血清预处理组GRP78 mRNA表达下降更加明显（P＜0.05）。见图2.

　　2.3  RTPCR方法观察ZBPYR含药血清对Tm刺激Neuro2a后CHOP mRNA表达的影响  各浓度含药血清组与对照组相比，CHOP mRNA表达差异无统计学意义，说明血清对Neuro2a细胞CHOP mRNA表达没有影响；Tm（5 μg/ml）组与对照组相比，CHOP mRNA表达增强（P＜0.05）；10％空白血清预处理组与Tm（5 μg/ml）组相比，CHOP mRNA表达差异无统计学意义；而各浓度ZBPYR含药血清预处理组CHOP mRNA表达与Tm（5 μg/ml）组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）；10％药物血清预处理组与10％空白血清预处理组相比，CHOP mRNA表达差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2.

　　图1  LDH检测Tm刺激细胞后各组细胞LDH泄漏率（略）

　　Figure 1  LDH leakage from each group treated by Tm

　　**P＜0.01， vs normal control group； △P＜0.05， △△P＜0.01， vs Tmtreated group； ▲P＜0.05， vs 10％ control serumtreated group （n=4 for each group）。

　　图2  RTPCR法观察Tm刺激各组细胞后GRP78和CHOP mRNA表达（略）

　　Figure 2  Expressions of GRP78 and CHOP mRNAs in different groups treated by Tm （RTPCR）

　　Results of RTPCR electrophoresis from each group and values of IOD from each group （n=4 for each group）。 *P＜0.05， vs normal control group； △P＜0.05， vs Tmtreated group； ▲P＜0.05， vs 10％ control serumtreated group.

　　2.4  LDH释放试验检测STS刺激Neuro2a后LDH泄漏率的变化  STS 0.1 μmol/L组与对照组比，LDH泄漏率升高（P＜0.01）；而加入15％空白血清预处理组与STS组相比，LDH泄漏率下降（P＜0.05）；15％ ZBPYR含药血清预处理组与STS组相比，LDH泄漏率下降（P＜0.01）；15％ ZBPYR含药血清预处理组与15％空白血清预处理组相比LDH泄漏率下降更加明显（P＜0.05）。见图3.

　　图3  LDH检测STS刺激细胞后各组细胞LDH泄漏率（略）

　　Figure 3  LDH leakage from each group treated by STS

　　**P＜0.01， vs normal control group； △P＜0.05， △△P＜0.01， vs STStreated group； ▲P＜0.05， vs 15％ control serumtreated group （n=4 for each group）。

　　3  讨论

　　ERS是细胞的一种应激反应过程，糖饥饿、钙平衡紊乱、糖基化抑制和二硫键合成减少等情况下，内质网的微环境发生改变，蛋白质的折叠受到影响，导致大量未折叠或错误折叠的蛋白质堆积于内质网内，由此引起一系列以分子伴侣和折叠酶表达上调为标志的应答反应，称为未折叠蛋白反应（unfolded protein response， UPR）。通过UPR细胞才能在应激情况下存活。分子伴侣GRP78与凋亡促进因子CHOP是ERS时表达增多的两种分子，被看作是ERS的标志，在ERS中起着不同的作用。其中GRP78能保护细胞，而CHOP则是促进细胞凋亡。因此通过药物干预后研究它们的表达情况可以进一步了解药物对ERS的作用。AD是一种常见的神经退行性疾病，病理特征为淀粉样蛋白的沉积、神经原纤维缠结、tau蛋白异常磷酸化和区域选择性神经元死亡［1］。AD与基因突变有关，主要有编码淀粉样蛋白前体基因（amyloid protein precursor， APP）和早老素（presenilin， PS）基因，这些基因都与内质网有关。AD相关的早老素突变，诱导内质网应激反应并且通过改变APP的蛋白水解加工作用而部分地增强对应激诱导的凋亡的易损性。PS1突变通过细胞表面有活性的钙离子流入的直接减少，不依赖APP，并间接地通过APP处理作用和淀粉样肽的产生增加内质网钙离子释放来解除对神经元钙离子稳态的控制。这种钙离子稳态的干扰将改变APP的加工，过量生成β淀粉样蛋白142（amyloid βprotein 142， Aβ142），同时内质网钙失衡，激活钙蛋白激酶，切割内质网膜上的caspase12，从而激活caspase12介导的内质网特异性凋亡路径，最终形成AD的病理变化［2］。除了钙离子失调，PS突变下调UPR并增强对内质网应激的易损性［3］。PS1突变还诱导了一个内质网中与应激介导的凋亡途径有关的凋亡前因子CHOP的表达［4］。PS是γ分泌酶复合物的一部分，与β分泌酶一起，裂解APP产生Aβ，并且PS突变增加总Aβ和Aβ142的产生。Aβ能直接引发内质网的钙离子释放并且诱导了内质网应激和神经毒性［5］。因而，在AD中内质网应激是引发和调节神经元死亡的一个主要事件。现有研究显示在AD神经元死亡中内质网应激凋亡途径和线粒体损伤的凋亡途径相互影响，起着调控凋亡级联反应的作用［6］。中医认为人体的生长、发育和衰老与“肾”密切相关。“肾精虚衰”是衰老的主要原因。同时又认为“脾胃为血气阴阳之根蒂”，“脾胃既和，其人寿；脾胃不和，其人夭”，因此也重视奉养脾胃精气在延年中的作用［7］。老年痴呆发病于老年期。老年期脾胃气衰，饮食减少，脾虚则化源不足，脑髓失养，神机失调而发为本病。因此脾虚是老年性痴呆的基本病机，脾的功能衰退在老年性痴呆发病过程中起着主导作用，并贯穿于全过程［8］。脾的生理功能是脾之阴阳共同作用的结果。脾阴是指存在于脾脏的阴液（包括血、津液和水谷精微等）和脾的物质形态及其滋润濡养功能。由于脾与大脑关系密切，脾阴亏虚严重影响大脑的意识、学习、思维、记忆和情绪等功能，导致一系列与脑相关的精神意识病证如意识不清、学习记忆能力下降和情绪失常等。因此，滋补脾阴应当是防治老年痴呆的一个重要措施。滋补脾阴方药由清代吴澄《不居集》中资成汤加味而成，以人参补脾益气生津，山药益胃补脾养阴，白芍养阴缓急，丹参活血养血益阴，茯苓健脾安神益智等，共奏健脾益阴之效。本组以往的研究显示，滋补脾阴方药能通过改善老龄大鼠脑细胞线粒体膜Na+K+ATP酶、Ca2+Mg2+ATP酶活性，调节膜磷脂代谢障碍和修饰膜的作用［9］，以及延缓兴奋性氨基酸受体N甲基D门冬氨酸（NmethylDaspartic acid， NMDA）受体、γ氨基丁酸（gammaaminobutyric acid， GABA）受体染色阳性神经元在衰老过程中丧失，同时抑制神经胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein， GFAP）的表达，起到神经保护、延缓脑衰老的作用［10］。本实验中Tm刺激Neuro2a细胞LDH释放试验结果表明，在加入滋补脾阴方药含药血清预保护后，可以明显降低Tm刺激细胞后的LDH泄漏率，结合RTPCR观察到滋补脾阴方药含药血清预处理后，内质网应激标志物GRP78及CHOP mRNA的表达受到抑制，两种实验结果的同步性可以推断滋补脾阴方药具有抑制内质网应激的作用。STS刺激Neuro2a细胞LDH释放试验结果表明，加入滋补脾阴方药含药血清预处理后，可以明显降低STS刺激细胞后的LDH泄漏率（STS是线粒体凋亡途径诱导剂）。因而表明滋补脾阴方药同时具有保护线粒体损伤的作用。以上的研究结果为滋补脾阴方药应用于临床防治AD提供了依据。AD是一种常见的神经退行性病变，其发病机制复杂，目前尚无有效的治疗手段，对社会和人们的生活造成严重的负担。现有的研究表明，神经元的凋亡在AD的发病过程中起着重要的作用。而内质网应激凋亡途径和线粒体损伤的凋亡途径已被证明在AD的发病过程中起着协同作用。我们的实验证明，滋补脾阴方药对内质网应激凋亡途径和线粒体损伤的凋亡途径具有双重作用，因而有助于AD的防治，加之中药治疗有着毒副作用低、经济实惠的优点，更易于为人们所接受。

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