【关键词】  胃肿瘤； 中药； 增殖细胞核抗原； 表皮生长因子受体； 裸小鼠

　　中医学认为恶性肿瘤的发生、发展、转移与痰邪为病有密切关系。魏品康教授根据多年临床经验研制出消痰散结复方治疗胃癌，取得较好疗效［1，2］。本研究建立裸鼠胃腺癌模型，观察该药对裸鼠胃腺癌体内生长的抑制作用及其对胃癌组织中增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen， PCNA）和表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor， EGFR）表达的影响，探讨消痰散结复方抑制胃癌细胞增殖的作用机制，现报告如下。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验材料

　　1.1.1  实验药物及主要试剂  消痰散结方由半夏、天南星、茯苓、白芥子、陈皮、全蝎、鸡内金、炙甘草等组成，均购自上海市药材公司，产地明确，经第二军医大学药学院生药学教研室鉴定。常规方法煎煮，浓缩至含生药0.46 kg/L备用。5氟尿嘧啶（fluorouracil， 5FU）10 ml，0.25 g，由上海旭东海普药业有限公司出品（批号060404），购自长征医院药房。主要试剂鼠抗人PCNA单抗（稀释度1∶100，代号M0879）和EGFR单抗（稀释度1∶20，代号M0886）购自美国DAKO公司。抗生物素蛋白链菌素过氧化物酶（streptavidin peroxidase， SP）连接法试剂盒和显色试剂盒，购自福建迈新公司。

　　1.1.2  实验动物  BABL/c裸鼠，雄性，共45只，体质量（20～22）g，8～10周龄，由中国科学院肿瘤生物技术研究所提供。医学实验动物合格证书，编号0742；裸鼠动物合格证书，医动字第02492号。

　　1.2  实验方法

　　1.2.1  裸鼠MKN45胃腺癌模型建立  裸鼠MKN45人胃腺癌细胞株由中国科学院肿瘤生物技术研究所提供。制备接种细胞悬液，无菌操作。体外培养MKN45细胞生长密集时，用0.05％胰蛋白酶和0.02％乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid， EDTA）消化1～2 min，倾出消化液，加入无血清1640液洗涤，离心，用无血清1640液配成接种细胞，浓度为2×106/ L.用相差显微镜观察呈均匀的单细胞悬液。皮下接种：无菌操作，消毒皮肤，取l ml注射器，抽吸出0.4 ml细胞悬液，接种在裸鼠右前肢根部皮下。裸小鼠皮下移植传代，取传代后14 d左右的裸小鼠，无菌操作，从腋部皮下剥取肿瘤组织，剔除纤维包膜，切开，选取生长良好、呈淡红色、鱼肉状瘤组织，切成1 mm×1 mm×1 mm小块，置于生理盐水中备用。裸鼠称质量后以75 mg/kg氯胺酮腹腔注射麻醉，沿上腹正中线切开约1 cm，将备好的肿瘤组织块植入。术后逐日观察肿瘤生长情况，以小鼠腹部出现可触及的包块作为成瘤标志，观察小鼠一般活动及营养状态等变化。

　　1.2.2  实验动物分组及用药  将接种后的BABL/c裸鼠随机分为3组，消痰散结方组、化疗组及荷瘤对照组，每组各15只，无特定病原菌（specific pathogen free， SPF）条件下分笼饲养于层流架内。消痰散结方组，于接种后次日开始每只裸鼠灌服消痰散结方浓缩煎剂0.4 ml/次（相当于生药9.2 g/kg体质量）1次/d，连续灌胃6周。空白荷瘤对照组，亦于接种后次日开始每只裸鼠灌服生理盐水0.4 ml/次，1次/d，连续灌胃6周。化疗组，5FU以生理盐水稀释成7.5 mg/ml，参照文献及本组以往研究经验按60 mg/kg腹腔注射，1次/周，连续用药3周。

　　1.2.3  移植瘤生长、小鼠活动及营养状况观察  接种后观察小鼠活动、进食及营养情况。6周后拉颈处死裸鼠，从腋部皮下完整剥取肿瘤组织，剔除纤维包膜，于电子天平上称取瘤质量。运用公式抑瘤率（%）＝（对照组治疗后平均瘤质量－用药组治疗后平均瘤质量）/对照组治疗后平均瘤质量×100计算抑瘤率。完成观察及称取质量的瘤组织用中性福尔马林固定，石蜡包埋，5 μm连续切片。

　　1.2.4  移植瘤组织PCNA、EGFR的测定  SP法，苏木素伊红染色，石蜡切片脱蜡至水，微波修复抗原。每张切片滴加一抗（鼠抗人PCNA、EGFR）1滴，4℃冰箱过夜，PBS冲洗3次后滴加生物素化二抗，每张切片上加1滴抗生物素蛋白链菌素过氧化物酶溶液，3，3‘二氨基及联苯胺底物显色10 min，二甲苯透明，中性树胶封闭。PCNA染色阳性物质呈棕黄色，颗粒状，位于胃癌细胞核内，在×200油镜下，随机计数200个以上的细胞作为分析基数，计数标记PCNA指数，即被标记细胞在一细胞群中所占的百分率。EGFR阳性染色大多位于胞浆及胞膜上，个别位于胞核上，为棕黄色颗粒，按染色深度和阳性细胞所占比例分别计分。（1）染色深度：0分，无着色；1分，浅着色；2分，深着色。（2）阳性细胞比例：0分，无着色；1分，着色≤1/3；2分，1/3＜着色≤2/3；3分，着色＞2/3.两项结果相加＞3分为阳性。

　　1.3  统计学处理  采用多个样本均数间两两比较F检验与不配对资料t检验，不同组间表达比率采用四格表资料的χ2检验，运用SPSS 10.0统计软件处理。

　　2  结果

　　2.1  消痰散结方对裸鼠MKN45胃腺癌生长的影响  荷瘤对照组在MKN45人胃腺癌接种于裸鼠皮下后14 d左右，腹部开始触及结节型肿块，以后逐渐增大。中药组晚于对照组触及肿块，化疗组又稍晚于中药组触及肿块。化疗组第23天死亡1只，且化疗后期裸鼠消瘦明显，懒动，饮水、进食状况均较差。对照组4周后也逐渐有类似情况，但较化疗组为轻。中药组裸鼠整个治疗周期活动、饮食生长状况均较稳定，优于前二者。6周后处死裸鼠，称取瘤质量，计算抑瘤率，化疗组和消痰散结方组抑瘤率分别为65.71%和52.72%，其瘤质量与荷瘤对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），化疗组较空白对照组差异亦有统计学意义（P＜0.01）。见表1.

　　表1  各组移植瘤瘤质量及抑瘤率（略）

　　Table 1  Tumor weight and inhibition rate in different groups

　　*P＜0.05， **P＜0.01， vs control group.

　　2.2  瘤组织病理学观察  瘤体组织切片在光镜下呈现低分化腺癌特征。对照组瘤细胞体积较大，呈椭圆形，胞浆红染，细胞核大而色深，核浆比例明显失调，化疗组与消痰散结方组的瘤细胞相对较小，核浆比例也相对接近正常，胞浆有空泡，核结构模糊。见图1.

　　图1  各组瘤组织病理学观察（HE染色， ×200）（略）

　　Figure 1  Pathological observation of tumor tissue （HE， ×200）

　　A： Control group； B： Xiaotan Sanjie Recipe group； C： 5FU group.

　　2.3  瘤组织中PCNA、EGFR表达  消痰散结方组PCNA阳性表达率低于空白对照组（P<0.05），化疗组PCNA阳性表达率与空白对照组比较，差异亦有统计学意义（P＜0.01），提示中药组及化疗组细胞增殖程度均不如空白对照组活跃，见表2和图2.EGFR阳性表达情况如图3及表3所示，消痰散结方可明显下调胃癌细胞膜EGFR表达。

　　表2  各组瘤组织中PCNA阳性表达（略）

　　Table 2  Positive expression of PCNA in different groups

　　*P＜0.05， **P＜0.01， vs control group.

　　图2  各组瘤组织中PCNA阳性表达（SP，×200）（略）

　　Figure 2  Positive expression of PCNA in different groups （SP， ×200）

　　A： Control group； B： Xiaotan Sanjie Recipe group； C： 5FU group.

　　图3  各组瘤组织中EGFR阳性表达（SP，×200）（略）

　　Figure 3  Positive expression of EGFR in different groups （SP， ×200）

　　A： Control group； B： Xiaotan Sanjie Recipe group； C： 5FU group.

　　表3  各组瘤组织中EGFR阳性表达（略）

　　Table 3  Positive expression of EGFR in different groups

　　*P＜0.05， **P＜0.01， vs control group.

　　3  讨论

　　肿瘤细胞无限增殖在一定程度上反映肿瘤细胞代谢和DNA合成状态。PCNA相对分子量为36 000，既是控制细胞DNA合成的必需非组蛋白核内多肽，也是细胞DNA合成期DNA多聚酶δ辅助蛋白。静止细胞中PCNA含量很少，细胞进入增生周期开始逐渐增加，S期达到高峰，G2期和Ml期明显下降，对DNA合成的调节和复制起重要作用。Tao 等［3］发现PCNA标记指数与胃癌的浸润、分期密切相关，国内文献研究也证实PCNA的表达与肿瘤细胞增殖活性密切相关［4～6］，故PCNA被认为是能较好判断细胞增殖活性的内源性标记物，细胞增殖活性又反映肿瘤的恶性倾向。肿瘤自分泌假说认为，生长因子受体质或量的异常，生长因子类物质产生的异常，受体后信号传导系统紊乱，生长因子或抑制因子减少等等，均可导致细胞生长调节机制失控，细胞恶性增殖可引起肿瘤发生。EGFR具有酪氨酸蛋白激酶活性，当与表皮生长因子结合形成复合体后，其自身酪氨酸残基被磷酸化，几乎所有信号传导通路均以蛋白激酶或磷酸酶的激活作为调节细胞生物效应的手段，或作为与其他信号系统相互沟通联系的交汇点［7］。研究表明EGFR在生理状态下对细胞生长和分化具有调节作用，当EGFR过度表达时，可引起细胞生长增殖调节机制的失控，导致细胞恶性增殖［8，9］。胃癌属于中医学“伏梁”、“积聚”、“胃脘痛”、“胃反”、“噎膈”等病证范畴，文献对其形成的病因病机有诸多描述，其中“痰凝”为重要病理因素之一。魏品康教授30余年来一直从事消化系统恶性肿瘤防治工作，认为胃癌多因长期饮食不慎，劳倦所伤，影响脾胃运化功能，导致水湿不化，日久凝聚为痰，进一步影响气血运行，导致痰凝血壅，结而成块，故而主张消痰散结论治，驱邪为主，邪去则正安，遂拟定消痰散结方。方中以南星、半夏、陈皮、白芥子等消痰散结，再以全蝎破瘀散结，甘草调和诸药，并与鸡内金等协助减轻南星、半夏、全蝎毒副作用，攻补兼施，但偏重于攻。在临床应用多年，证实可明显改善患者生活质量，提高中位生存期［1］。本实验即在临床研究基础上，建立裸鼠胃癌模型，从实验研究角度对其作用机制进行探讨，结果提示消痰散结方对裸鼠移植瘤生长有一定抑制作用，并进一步检测了不同分组胃癌组织中反应细胞增殖活性的PCNA表达，以及对细胞生长增殖有调节作用的EGFR表达，结果提示消痰散结方能下调细胞PCNA标记指数以及细胞膜EGFR表达，与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05），表明消痰散结方可通过抑制PCNA蛋白和细胞膜EGFR表达，干扰肿瘤细胞DNA合成，对细胞增殖相关信号通路产生影响，进而抑制胃癌细胞增殖。本文从实验研究角度证实了消痰散结方的抗肿瘤功效，有关此方药的作用机制值得进一步深入探讨。

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