【关键词】  乙型肝炎病毒

　　Expression and purification of truncated C gene combined with preS1 gene from HBV in E.coli

　　HU XingBin， YIN Wen， WEI SanHua， LEI YingFeng， L Xin， SUN MengNing， YANG Jing， XU ZhiKai

　　Department  of  Microbiology， School of Basic Medicine， Fourth Military Medical University， Xian 710033， China

　　【Abstract】 AIM： To construct the prokaryotic recombinant plasmid to express HBV truncated C gene with preS1 gene and to acquire and purify the fused protein for antigenic analysis. METHODS：  The target gene was amplified by PCR and digested by restrictive enzyme before  cloned into pET28a. It was then transformed into E.coli DH5α and the positive recombinant plasmid named pET28aCtpreS1 was sequenced. The target protein was distinctly expressed after transformed into E.coli BL21 and induced with IPTG. The protein was scanned and purified on Ni2+NTA column and Western blot was performed after solubility analysis. RESULTS：  The recombinant plasmid pET28aCtpreS1 was successfully constructed and could efficiently express the target gene. Protein production mainly was in inclusion body but could be purified through Ni2+NTA column. The purified protein maintained the antigen activity. CONCLUSION：  The truncated HBcAg combined with preS1 antigen can efficiently be expressed and purified， which lays a foundation for further research of novel vaccine against HBV.

　　【Keywords】 hepatitis B virus； fused protein； prokaryotic expression； vaccine

　　【摘要】 目的： 构建乙型肝炎病毒（HBV）截短C基因和前S1基因重组原核表达质粒，获得融合蛋白的表达并进行抗原性分析。 方法： PCR扩增获得截短C基因片段和前S1基因，双酶切后克隆至原核表达质粒pET28a，转化E.coli DH5α，酶切鉴定得阳性重组质粒pET28a并测序；然后转化E.coli BL21，IPTG诱导融合蛋白表达，薄层扫描分析表达蛋白组成；可溶性分析后用Ni2+NTA凝胶亲和层析柱纯化、透析并浓缩融合蛋白，Western Blot分析特异性和抗原性。 结果： 成功构建了HBV 截短C基因和前S1基因融合的原核表达质粒pET28aCtpreS1，目的基因可高效表达，表达产物主要以包涵体形式存在，Ni2+NTA 纯化可获得目的蛋白，纯化蛋白具有良好的抗原性和特异性。 结论： HBV截短HBcAg和preS1抗原融合蛋白可高效表达并得到纯化，为研究新型乙肝疫苗奠定了基础。

　　【关键词】 乙型肝炎病毒；融合蛋白；原核表达；疫苗

　　0引言

　　乙型肝炎病毒（hepatitis B virus， HBV）导致的病毒性肝炎目前尚无十分有效的治疗措施，疫苗接种是控制和预防乙型肝炎的重要手段，但部分人群对现有的疫苗不应答或低应答而导致接种失败，因此需要研发新型HBV疫苗。 我们利用基因重组技术构建含截短C基因和preS1基因联合的原核表达载体，在大肠杆菌中表达融合蛋白并进行纯化，初步分析其免疫性和特异性，为比较不同来源的HBV候选疫苗分子和深入研究HBV新型疫苗奠定基础。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　E.coli  DH5α和BL21菌株由本实验室保存；pET28a质粒由范雄林博士惠赠； 带HBV截短C基因和preS1基因的质粒pDE22CtpreS1w由本实验室构建； Taq DNA聚合酶、限制性内切酶（TaKaRa公司）；胶回收试剂盒（上海华舜公司）；T4 DNA连接酶（上海生物工程公司）；Ni2+NTA凝胶亲和层析柱（Qiagen公司）；HRP标记羊人IgG，DNA 分子标准和低分子蛋白质标准（华美生物工程公司）。

　　1.2方法

　　1.2.1PCR引物设计与合成根据GenBank中的HBV C基因和前S1基因序列，利用生物学信息软件设计其扩增引物，以扩增C基因编码蛋白N端155个氨基酸的基因片段和前S1全基因。 上游引物P1：5′GCGGAATTCATGGACATTGACCCGTATAAAG3′，含EcoRⅠ酶切位点；下游引物P2：5′GCGAAGCTTTTAACCCAGCCCGAATGCTCC3′，含HindⅢ酶切位点和终止码TTA. 交上海生物工程公司合成。

　　1.2.2目的基因的扩增以pDE22CtpreS1w质粒为模板进行PCR扩增，反应体系为：质粒（1∶100稀释）5 μL，10×Buffer 5 μL ，10 mmol/L dNTPs 4 μL，P1（100 pmol/L）2 μL，P2（100 pmol/L）2 μL，Taq DNA聚合酶 2 μL，用超纯水补至终体积50 μL. 反应条件：预变性94℃ 5 min；94℃ 1 min，56℃ 50 s，72℃ 1 min，共进行30个循环，最后在72℃延伸10 min. 取5 μL反应产物进行琼脂糖电泳分析。

　　1.2.3pET28aCtpreS1重组质粒的构建及鉴定连接、转化、重组质粒鉴定均参照文献［1］进行，将酶切鉴定正确的重组质粒交由北京三博远志公司测序。

　　1.2.4蛋白表达和可溶性分析自DH5α中提取阳性重组质粒，转化大肠杆菌BL21，挑取单菌落（同时设空载体质粒转化的大肠杆菌BL21为对照），置5 mL LB培养液中（含卡那霉素50 g／L），37℃振摇过夜，次日1∶100的稀释度加入5 mL LB培养液中37℃振摇3 h后，测定A600 nm约0.4～0.6时加入IPTG至终浓度1 mmol/L，37℃继续振摇4～5 h，离心收菌。 用PBS（pH 8.0）悬浮离心收集的细菌，加入溶菌酶至终浓度0.1 g/L，4℃放置20 min，超声破碎，4℃下10 000 g离心10 min，收集上清和沉淀。 将菌体沉淀、裂解上清、裂解沉淀和空质粒转化菌分别加入等体积的2×样品缓冲液，沸水中加热5 min，12 000 g离心5 min，取上清，每孔15 μL进行SDSPAGE电泳，电泳在恒压下进行（浓缩胶中为100 V，分离胶中为120 V）。 电泳结束后，将凝胶浸泡于考马斯亮蓝染色液中染色2 h，然后用脱色液脱色至背景清晰。 薄层扫描分析目的蛋白表达带占菌体蛋白百分比。

　　1.2.5亲和层析法纯化表达蛋白参照Qiagen公司镍离子亲和层析柱（Ni2+NTA）操作说明进行。 首先离心收集1 L诱导宿主菌，冰浴15 min；按5 L/kg湿菌的比例加入含8 mol/L尿素 的Buffer B（pH 8.0），室温下轻轻搅拌使细菌裂解至溶液清亮，4℃下10 000 g离心收集上清，弃去沉淀；将1 mL Ni2+NTA树脂悬浮液与一定量清亮裂解上清于室温轻柔摇动混匀（100 r/min摇动15～60 min） 后，将其混合液装柱；依次用 Buffer C（pH 6.3）， Buffer D（pH 5.9）， Buffer E（pH 4.5）洗脱，分别收集洗脱液。 取各部分样品进行SDSPAGE分析。

　　1.2.6Western Blot检测表达蛋白将纯化蛋白进行SDSPAGE凝胶电泳，然后将蛋白质进行电转移至NC膜上（滤膜孔径0.22 μm，转移条件为恒流100 V，1 h）。 用乙型肝炎阳性患者抗HbcAg，抗preS1阳性血清（来自西京医院检验科）作为一抗，HRP标记羊抗人的IgG作为二抗，DAB（0.6 g／L）显色，至目的条带染色清晰时终止反应。

　　2结果

　　2.1重组表达质粒的鉴定阳性重组质粒酶切产物预期大小（约630 bp）处出现条带（图1）。 序列测定结果与文献报道一致。

　　2.2融合蛋白的表达与溶解形式分析经SDSPAGE电泳检测，在Mr约24 000处有一明显的条带，与预期的融合蛋白大小一致。 该融合蛋白以包涵体形式存在于沉淀中，上清液中几乎无诱导表达的融合蛋白。 薄层扫描显示其占菌体蛋白的40%（图2）。

　　2.3融合蛋白的大量表达及纯化目的蛋白在Buffer D（pH 5.9），Buffer E（pH 4.5）洗脱液中，扫描显示纯度在90%以上（图3）。

　　2.4表达蛋白的Western blot预期大小处可见条带染色清晰，纯化的蛋白很好地保持了与HBV阳性患者血清的结合活性（图4）。

　　3讨论

　　疫苗是预防HBV感染的重要手段，但相当数量的接种者对现临床使用的疫苗无应答或低应答，而为数众多的感染者需要有效的治疗，所以迫切需要新型HBV疫苗。

　　抗原特异性CTL所介导的细胞毒作用在病毒感染的控制和痊愈过程中起核心作用［2-3］。 多个CTL表位的疫苗研究策略是近年各类HBV新型疫苗研究的热点。 HBV核心C基因在不同亚型间最为保守， 在它编码的180多个氨基酸中，CTL表位多位于第150位氨基酸（amino acid， AA）以前，其中18～27位AA为HLAA0201所限制，第88～96位AA被HLAA11所限制，第141～150位AA为HLAAw68和HLAA31分子所限制，此外第75～81位AA或72～88位AA是很强的构像型B细胞表位，因此核心抗原是比较理想的疫苗研究靶分子［4-5］。 在既往HBV疫苗研究中人们大多选用S基因编码的蛋白，并辅以CpG， IL2等分子佐剂试图达到免疫目的，但效果并不理想［6-7］。 而preS1基因编码蛋白含有HBV和肝细胞膜结合的位点，并且相当保守， 肝细胞、B细胞和T细胞均可表达针对其第21～47位AA的受体，故前S1抗体是除表面抗体外又一重要的中和抗体［8］。 因此HBV的C基因和preS1基因已经成为近年来HBV新型疫苗研究的重点［9］。

　　几乎所有新型HBV疫苗如亚单位疫苗、DNA疫苗、分枝肽合成疫苗、新载体疫苗或植物转基因疫苗的前期研究工作中都需要候选分子高效表达，以便在体外评价疫苗候选分子刺激细胞增殖的潜力和CTL杀伤效应，达到全面评价候选分子的目的［10-12］。 而HBV各个基因片段原核表达难易程度不同，考虑到C基因原核表达难度低，本研究采用将截短C基因置于preS1基因前面的方式，构建了原核重组表达质粒并获得了高效表达。 目的蛋白纯化以后，Western blot进一步证实该浓缩蛋白可以与抗HBcAg、抗preS1阳性患者血清结合，具有很好的抗原性和特异性，可用于进一步的HBV新型疫苗研究；与Chen等［9］采用经典的preS1基因在前、C基因在后的表达方式所获取的同类蛋白相比，本研究中蛋白表达量明显较高。 在后续工作中，我们将选用新型的疫苗载体BCG运载候选疫苗分子，进一步研究该蛋白在CTL免疫和体液免疫中的作用。

　　【参考文献】

　　［1］ Sambrook J， Fritsh EF， Maniatis T. Molecular cloning：A laboratory manual［M］。 3rd  ed. New York： Cold Spring Harbor， 2002：1228-1230.

　　［2］ Kakimi K， Isogawa M， Chung J， et al. Immunogenicity and tolerogenicity of hepatitis B virus structural and nonstructural proteins： Implications for immunotherapy of persistent viral infections ［J］。 Virology， 2002，76（9）： 8609-8620.

　　［3］ Loirat D， Lemonnier FA， Michel ML. Multiepitopic HLAA*0201restricted immune response against hepatitis B surface antigen after DNAbased immunization ［J］。 Immunology， 2000， 165（7）： 4748-4755.

　　［4］ Townsend K， Saillberg M， O del J， et al. Characterization of CD8 cytotoxic Tlymphocyte responses after genetic immunization with retrovirus vectors expressing different forms of the hepatitis B virus core and e antigens ［J］。 Virology， 1997，71（5）： 3365-3374.

　　［5］ Thimme R， Chang KM， Pemberton J， et al. Degenerate immunogenicity of an HLAA2restricted hepatitis B virus nucleocapsid cytotoxic Tlymphocyte epitope that is also presented by HLAB51 ［J］。 Virology， 2001，75（4）： 3984-3987.

　　［6］ Davis HL， Suparto H， Weeratna R， et al. CpG DNA overcomes hyporeponsiveness to hepatitis B vaccine on orangutans ［J］。 Vaccine， 2000， 18： 1920-1924.

　　［7］ Bres EM， Payette PJ， Mancini M， et al. CpG oligodeoxynucleotides with hepatitis B surface antigen for vaccination in HBsAgtransgenic mice ［J］。 Virology， 2001，75（7）： 6482-6491.

　　［8］ Shi TD， Wu YZ， Jia ZC， et al. Therapeutic polypeptides based on HBcAg1827 CTL epitope can induce antigenspecific CD8+ CTLmediated cytotoxicity in HLAA2 transgenic mice ［J］。 World  J Gastroenterol， 2004， 10（8）： 1222-1226.

　　［9］ Chen XC， Li XZ， Le XH， et al. Recombinant hepatitis B core antigen carrying preS1 epitopes induce immune response against chornic HBV infection ［J］。 Vaccine， 2004， 22（7）： 2878-2885.

　　［10］ Wen YM， Qu D， Zhou SH， et al.Antigenantibody complex as therapeutic vaccine for viral hepatitis B［J］。 Int Rev Immunl， 1999，18（3）： 251-260.

　　［11］ Walmsley AM， Amtzen CJ. Plants for delivery of edible vaccines ［J］。 Curr Opin Biotechnol， 2000， 11：126-130.

　　［12］ Singh M， Cattaneo R， Billeter MA， et al. A recombinant measles virus expressing hepatitis B virus surface antigen induces humoral immune responses in genetically modified mice ［J］。 Virology， 1999， 73（6）： 4823-4828.