【摘要】  观察高蛋白饮食及大量蛋白尿对慢性肾功能衰竭（chronic renal failure， CRF）大鼠的加重损害作用。方法：通过先用5/6肾切除大鼠法制作CRF动物模型，成功后再分别给予5/6肾切除大鼠不同蛋白饮食喂养2个月，制作有大量蛋白尿的CRF动物模型。生化检测不同蛋白饮食喂养的5/6肾切除大鼠血尿素氮（blood urea nitrogen， BUN）、血清肌酐（serum creatinine， Scr）和24 h尿蛋白定量；放免检测血内皮素-1（endothelin-1， ET-1）、血栓素B2（thromboxane B2， TXB2）、6-酮-前列腺素Flα（6 ketone prostaglandin Flα， 6-Keto-PGFlα）；分光光度计比色法检测血和肾组织超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）、丙二醛（malondialdehyde， MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase， GSH-Px）水平。结果：高蛋白饮食及大量蛋白尿可通过加重CRF大鼠的血液动力学异常，升高TXB2和ET-1，降低血 6-keto -PGFlα；减弱大鼠血SOD和GSH-Px的活性，加速肾损害。结论：高蛋白饮食可通过导致5/6肾切除大鼠大量蛋白尿，影响肾脏血管活性物质表达，降低5/6肾切除大鼠抗氧化能力而加速CRF的进展。

　　【关键词】  肾功能衰竭， 慢性

　　蛋白尿既是各种慢性肾脏病的主要临床症状，又是慢性肾脏病进展的独立危险因素之一。已有研究表明，没有蛋白尿的肾小球肾炎，肾功能极少发生进行性衰退，大量蛋白尿对肾脏具有直接损伤作用，可以使原有的肾小球损害逐渐加重，促使肾小球硬化的发生［1］。因此，研究高蛋白饮食及大量蛋白尿加重慢性肾功能衰竭（chronic renal failure， CRF）进展的作用，具有重要的临床指导意义。本研究通过给予5/6肾切除大鼠高蛋白饮食，观察高蛋白饮食及大量蛋白尿对CRF大鼠的加重损害作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及造模 成年雄性SD大鼠40只， 6～8 周龄，体质量160～190 g，由上海必凯实验动物有限公司提供。大鼠在上海中医药大学实验动物中心分笼饲养，于12 h光照、45%左右相对湿度的普通设施中自由饮食。大鼠适应1周后，随机抽取 7只 作为正常对照组，其余33只为造模组，正常对照组给予自由进食及饮水。CRF模型制作参照文献［2］进行，造模组先以苯巴比妥（100 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，然后以乙醚诱导麻醉，使大鼠仰卧，后肢交叉固定于手术台上以暴露背部左肾区，从距左脊肋骨1.5 cm处作斜向外方切口。经后腹膜取肾脏，暴露皮质部分并以剪刀切除，用明胶海绵压迫止血片刻，再滴加数滴纤维蛋白原溶液或凝血酶溶液，稍等片刻，当切面上不再有活动性出血后复位剩余左肾，缝合，1周后切除整个右肾，2次手术共切除肾脏约80%左右。2周后在大鼠尾静脉采血测定血肌酐（serum creatinine Scr），造模组大鼠血肌酐明显高于正常对照组为造模成功，共有27只造模成功。再根据造模组大鼠的血肌酐值将其分为模型组、中蛋白组和高蛋白组，每组9只，各组间血肌酐差异无统计学意义（ P >0.05）。模型组给予普通饲料喂养；中蛋白组给予普通饲料+20%的蛋白喂养；高蛋白组给予普通饲料+40%的蛋白喂养，各组均自由进食及饮水，共喂养2月。实验结束，模型组死亡1只，中蛋白组和高蛋白组均死亡2只。

　　1.2 观察指标 提前1周开始收集各组大鼠的蛋白尿检测24 h尿蛋白定量，常规检测血尿素氮（blood urea nitrogen， BUN）和Scr.采用放射免疫法于曙光医院同位素室检测血内皮素-1（endothe-lin-1， ET-1）、血栓素B2（thromboxan B2， TXB2）和6-酮-前列腺素Flα（6 ketone prostaglandin Flα， 6-Keto-PGFlα）。采用分光光度计比色法检测血和肾组织超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）、丙二醛（malondialdehyde， MDA）和谷胱甘 肽过氧化物酶（glutathione peroxidase， GSH-Px）含量（每克肾组织加入2 ml蒸馏水中）。

　　1.3 肾组织匀浆制备 取下大鼠残肾组织即刻制成10%的组织匀浆，标本测定过程均严格按说明书要求进行。

　　1.4 统计学方法 所有数据用 x ± s 表示，应用SPSS 13.0统计软件，采用ANOVA过程进行多样本两两比较的 q 检验。

　　2 结果

　　2.1 肾功能及蛋白尿变化 不同蛋白饲料喂养 2个 月后，各造模组BUN均明显高于正常对照组（ P <0.05），各造模组之间随着蛋白饮食的增加，BUN虽然有上升趋势，但差异无统计学意义；各造模组血肌酐和蛋白尿值均明显高于正常对照组 （ P < 0.01），高蛋白组的血肌酐及24 h蛋白定量均明显高于模型组和中蛋白组（ P <0.05或 P < 0.01 ），模型组及中蛋白组24 h蛋白定量约为正常大鼠的10倍，而高蛋白组24 h蛋白定量约为正常大鼠的20倍，说明给予5/6肾切除大鼠高蛋白饮食，会使其24 h蛋白定量及血肌酐明显升高，从而建立有大量蛋白尿的CRF动物模型。见表1.

　　2.2 血管活性物质变化 模型组、中蛋白组及高蛋白组的血ET-1和TXB2均明显高于正常对照组（ P < 0.01），6-Keto-PGF lα明显低于正常对照组（ P < 0.01）；各造模组间血ET-1有上升趋势，而 6-Keto -PGF lα有下降趋势，但差异无统计学意义；而高蛋白组的血TXB2则明显高于模型组及中蛋白组（ P <0.05），提示CRF大鼠存在血管活性物质异常，且以TXB2异常更为明显，大量蛋白尿可通过升高CRF大鼠的血TXB2从而加重肾功能衰竭。见表2.

　　2.3 血氧化指标变化 各造模组血SOD和GSH-Px值明显低于正常对照组（ P <0.05， P <0.01）；随着蛋白饮食的增加，SOD和GSH-Px值下降，以高蛋白组最明显，高蛋白组SOD和GSH-Px值明显低于模型组（ P <0.05）。各造模组血MDA明显高于正常对照组（ P <0.01），随着蛋白饮食的增加，血MDA逐渐增加，以高蛋白组为甚，说明不同蛋白饮食喂养的CRF大鼠血氧化与抗氧化指标存在异常，以高蛋白组最严重，推测高蛋白饮食可明显降低CRF大鼠的SOD和GSH-Px，增加血MDA，加重CRF.见表3.

　　2.4 组织氧化指标变化 正常对照组大鼠肾组织的SOD和GSH-Px均明显高于各造模组（ P < 0.05， P <0.01），随着蛋白饮食的增加肾组织MDA有上升趋势，但差异无统计学意义。中蛋白组肾组织SOD明显低于模型组（ P <0.05）。 GSH-Px随蛋白饮食的增加无明显变化。见表4.

　　表1 不同蛋白饮食对CRF大鼠肾功能及蛋白尿的影响（略）

　　Table 1 Effects of protein diet on renal function and proteinuria in CRF rats

　　*P <0.05，**P <0.01， vs high-protein diet group；△△P <0.01， vs normal control group.

　　表2 不同蛋白饮食对CRF大鼠血管活性物质的影响（略）

　　Table 2 Effects of protein diet on vasoactive substances in CRF rats

　　*P <0.05， vs high-protein diet group；△P <0.05，△△P <0.01， vs normal control group.

　　表3 不同蛋白饮食对CRF大鼠血氧化指标的影响（略）

　　Table 3 Effects of protein diet on oxidation indexes of blood in CRF rats

　　*P <0.05， vs high-protein diet group；△P <0.05，△△P <0.01， vs normal control group.

　　表4 不同蛋白饮食对CRF大鼠肾组织氧化指标的影响（略）

　　Table 4 Effects of protein diet on oxidation indexes of renal tissue in CRF rats

　　*P <0.05， vs untreated group；△P <0.05，△△P <0.01， vs normal control group.

　　3 讨论

　　蛋白尿对肾小球的直接损害，是由于通过肾小球毛细血管的蛋白导致肾小球系膜扩张，而引起肾 小球滤过面积和滤过率下降。大量蛋白尿对肾小球上皮细胞及系膜细胞的内在毒性作用表现在肾小球超滤液中大量蛋白尿可引起上皮细胞的形态改变，如足突融合和消失，继而出现持续性结构和功能改变，包括肾小球的变性、坏死和上皮细胞从基底膜分离，肾小球硬化，且蛋白尿的大量漏出，使近端小管细胞蛋白负荷过重，小管细胞膨胀、破裂而释放出溶酶体酶导致小管间质损害及纤维化，导致CRF［3］。进一步研究显示，过量的蛋白在肾小管上皮细胞的沉积可刺激某些生长因子如血小板源生长因子（platelet-derived growth factor， PDGF）以及转化生长因子β等的产生，这些细胞因子可引起肾小管上皮细胞的活化、大量胶原的产生和间质细胞的增殖，最终导致间质纤维化和CRF的出现［4］。可见，高蛋白饮食及大量蛋白尿可直接损害肾小球和肾小管而加重肾损害。已知ET是一种具有很强的含21个氨基酸、分子量为2 492 D的血管收缩小分子活性肽。在CRF大鼠及患者血、尿及肾组织局部ET-1含量增高，可加重肾脏损害：（1）ET对血管有强大的收缩作用，而肾血管对ET的反应尤为敏感。ET对肾小球出球动脉的收缩作用强于入球动脉，从而使肾小球毛细血管内压升高，还可收缩肾小球系膜细胞使肾小球滤过面积和超滤系数减少，并可剂量依赖性地减少肾血流量，降低肾小球滤过率［5］；（2）ET-1促进血管平滑肌及肾髓质间质细胞增殖及间质纤维化，直接或间接刺激醛固酮分泌，影响肾素活性及促炎症作用［6］。血栓素A2（thromboxane A2， TXA2）和前列环素I2（prostacyclin I2， PGI2）均系花生四烯酸的代谢产物。正常时保持动态平衡，对维持血小板功能、保护血管和防止血栓形成具有重要意义，因而PGI2与TXA2是调节血小板及血管壁机能状态的两个生物学对立面。PGI2可拮抗内皮素所引起的肾血管收缩，有负反馈调节作用。血管损伤可引起TXA2等致炎因子释放，这些炎症介质大多能刺激ET的合成和分泌，而ET又可促进TXA2、白细胞介素6 （interleukin -6， IL-6）等炎症介质的生成［7，8］。TXB2和6-Keto-PGF1α为TXA2和PGI2的终末代谢产物，可反映TXA2和PGI2两者水平。若TXA2增多和（或）PGI2减少，TXA2/PGI2比值升高，可导致血小板活化增强和血管收缩，促进血栓形成和血管损伤［9，10］。本研究中各造模组大鼠的血ET-1以及模型组、高蛋白组的TXB2明显高于正常对照组，而造模组的6-Keto-PGF1α明显低于正常对照组，且随着蛋白饮食的增加模型大鼠血ET-1有上升趋势，而6-Keto-PGF1α则有下降趋势，TXB2在高蛋白组上升更明显，明显高于模型组及中蛋白组，表明CRF各造模组大鼠均存在血管活性物质的异常，而高蛋白饮食使肾 脏血管活性物质异常表达更明显。可见高蛋白饮食可通过加重CRF大鼠血管活性物质异常表达，而加速肾脏的病理进程。在正常情况下肾组织内大约1%～2%的氧发生单电子转移形成自由基，因肾组织内含有丰富的SOD、过氧化氢酶、GSH-Px及其他抗氧化物质，产生的自由基很快被清除。因此肾组织内抗氧化能力与不断产生自由基的氧化能力之间保持着动态平衡，不引起肾组织损伤［11］。本研究结果表明，各造模组血SOD、GSH-Px值明显低于正常对照组（ P <0.05， P <0.01），随着蛋白饮食的增加，SOD和GSH-Px值下降，以高蛋白组最明显。高蛋白组SOD和GSH-Px值明显低于模型组（ P <0.05）。各造模组血MDA明显高于正常对照组（ P <0.01），随着蛋白饮食的增加，血MDA逐渐增加，以高蛋白组为重，说明不同蛋白饮食喂养的CRF大鼠血存在氧化与抗氧化能力动态平衡异常，以高蛋白组最严重。但组织的变化不明显，正常对照组大鼠肾组织的SOD和GSH-Px均明显高于各造模组（ P <0.05， P <0.01），随着蛋白的增加肾组织MDA有上升趋势，但差异无统计学意义。造成这一现象的原因可能与各造模组大鼠组织氧化物质变化首先表现于血液，随着病程的进展，组织病变日益严重，因此增加实验周期可能有助于检测组织氧化物质的变化。上述情况说明不同蛋白饮食喂养的CRF大鼠存在氧化和抗氧化系统的异常，导致氧自由基的产生增多，已知后者可进一步通过以下途径损伤肾脏：（1）氧自由基可直接损伤肾小球内皮、上皮及系膜细胞，造成内皮细胞脱落，上皮细胞空泡变性，足突融合，基底膜（glomerular base-ment membrane， GBM）暴露，系膜基质溶解，系膜基质代偿增多；（2）由于上述病变，改变肾小球毛细血管和GBM的通透性及肾小球内血流动力学，造成大量持续性蛋白尿，反之这些蛋白尿加重系膜细胞及肾小球的损伤；（3）转化生长因子β和PDGF等多种细胞因子在CRF时产生增多，通过ROS进一步损伤肾组织［12，13］；（4）脂质过氧化物使纤维母细胞对胶原基因的表达增加，促进胶原在系膜区沉积，加重肾间质纤维化，使肾组织结构和形态改变，肾功能进行性损害［14］。可见，高蛋白饮食及大量蛋白尿既可直接损害肾脏，又可间接通过影响肾脏的血管活性物质分泌、减弱机体的抗氧化能力而加速肾脏病的恶化。因此，临床上CRF患者采取低蛋白饮食是非常必要的。

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