【摘要】为了研究儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）中E2A-PBX1融合基因的表达，采用位于E2A基因不同位置的上游引物与下游PBX1引物，检测了410例儿童ALL，包括362例B细胞ALL和48例T细胞ALL.结果发现：17例患儿携带E2A-PBX1融合基因，检出率4.1%，且全部为B细胞ALL，而且所有阳性病例均表达一种变异型融合转录本，后者是由E2A基因的第13外显子（159bp）被差异剪切形成的。经BLASTn比对分析，这种转录本保持了原来的开放阅读框，但导致53个氨基酸残基的丢失。这53个氨基酸残基位于活化区2，会导致融合蛋白中部分环-螺旋结构以及全部七聚体亮氨酸重复序列的丢失。结论：携带E2A-PBX1融合基因的儿童ALL表达典型和变异型2种融合转录本，后者是由E2A基因第13外显子被差异剪切而形成的，它将导致融合蛋白中53个氨基酸残基及其所构成的部分环-螺旋结构以及全部七聚体亮氨酸重复序列的丢失。

　　【关键词】急性淋巴细胞白血病

　　在本研究中，我们利用两套PCR引物，研究了儿童ALL的E2A-PBX1融合基因表达。发现所有携带E2A-PBX1融合基因的患儿除具有典型融合转录本外，全部携带一种变异型融合转录本。

　　材料和方法

　　病例从2000年12月至2004年12月我院共收治410例儿童ALL，其中包括362例B细胞ALL和48例T细胞ALL.所有患儿均行骨髓细胞形态学、细胞化学染色及免疫学检查，部分患儿进行细胞遗传学检查。我们采用多重巢式RT-PCR方法［6］在17例患儿检出E2A-PBX1融合基因，检出率4.1%。17例患儿中，男6例，女11例，年龄11个月到12岁，中位年龄7岁。医学教育网搜集整理

　　方法

　　标本抽取初诊患儿的1ml骨髓液，EDTA-K2抗凝。采用红细胞裂解液（含0.1%KHCO3、0.83%NH4Cl、0.0037%EDTA-Na2）裂解红细胞。约106单个核细胞用于提取细胞总RNA.

　　提取细胞总RNA及逆转录反应采用TRIZOLReagent（购自美国Invitrogen公司）提取细胞总RNA.利用MMLV逆转录酶及随机六聚体（购自美国Promega公司）为引物将RNA逆转录为cDNA，-20℃冻存备用。

　　对照基因ABL的扩增为避免RNA降解造成的假阴性，以ABL基因作为对照。引物序列和扩增条件分别见参考文献［7］和［8］。

　　E2A-PBX1融合基因的巢式PCR扩增①典型融合转录本的扩增：引物序列［9］和位置。PCR扩增条件包括：25μl反应体系，含有10mmol/LTris·HCl（pH8.3），50mmol/LKCl，0.2mmol/LdNTPs，1.5mmol/LMgCl2，3.75pmol引物，2μlcDNA（第1轮反应）或1μl第1轮PCR产物（第2轮反应），1UTaqDNA聚合酶。93℃预变性3分钟，93℃变性40秒，51℃退火45秒，72℃延伸40秒，共35个循环，最后72℃延伸10分钟。②变异型融合转录本的扩增：引物序列［10］和位置。PCR扩增条件包括：25μl反应体系，含有10mmol/LTris-HCl（pH8.3），50mmol/LKCl，0.2mmol/LdNTP，1.32mmol/L（第1轮反应）或1.44mmol/L（第2轮反应）MgCl2，5pmol（第1轮反应）或6.25pmol（第2轮反应）引物，2μlcDNA（第1轮反应）或1μl第1轮PCR产物（第2轮反应），1UTaqDNA聚合酶。95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共25个循环，最后72℃延伸10分钟。

　　聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染色按照本室的常规方法进行。

　　PCR产物的测序取100μl的变异型E2A-PBX1扩增产物送上海博亚公司，采用PE公司ABI377型测序仪，利用E2A-4和PBX1-4两条引物从双向测定DNA序列。将DNA序列输入BLASTn进行序列比对。

　　结果

　　E2A-PBX1融合基因和ABL基因的扩增

　　根据文献报道，采用E2A-1、PBX1-1、E2A-2和PBX1-2进行巢式PCR，可以获得典型融合转录本扩增片段［9］。我们的结果证实了上述结论，阳性片段大小为159bp。医学教育网搜集整理

　　根据文献报道，采用E2A-3、PBX1-3、E2A-4和PBX1-4进行巢式PCR，可以获得典型融合转录本扩增片段，大小为376bp［10］。我们的结果除获得376bp的阳性片段外，尚可见217bp的片段。

　　所有标本均可见ABL基因扩增片段。

　　变异型融合转录本扩增片段的测序和BLASTn比对

　　将双向测序结果加以拼接，并输入BLASTn进行比对分析，发现该片段是由E2A基因的第13外显子（159bp）剪切所形成。剪切并未影响PBX1基因和开放阅读框，因此没有形成移码突变。

　　讨论

　　t（1；19）易位在衍生19号染色体上形成了E2A-PBX1融合基因。在mRNA水平，由E2A基因的第14外显子和PBX1基因的第12外显子相连接形成融合转录本［11］。目前已发现2种E2A-PBX1转录本，编码2种融合蛋白，P85和P77，二者只在PBX1部分的羧基端存在差异，并都具有转化特性，属于癌蛋白［11］。

　　本研究发现的变异型融合转录本是由E2A基因的第13外显子被差异剪切掉形成的，若要检测出这种转录本，所用E2A引物必须位于第12外显子及其上游。文献中用于扩增E2A-PBX1融合转录本的引物较多，其中E2A引物大多位于第13或14外显子，少数位于第12与13外显子交界处。本研究使用的E2A-1位于第12-13外显子交界处，其3‘端有13个碱基位于第13外显子内，E2A-2位于第13-14外显子交界处，其5’端有12个碱基位于第13外显子内，因此只能扩增出典型融合转录本。而E2A-3和E2A-4均位于第12外显子，因此能够同时扩增出典型和变异型两种融合转录本。另一方面，测序结果也证实了变异型转录本的存在。综合两套引物的检测结果，可以认为所有患儿的白血病细胞都同时表达两种融合转录本。至于使用E2A-3和E2A-4只在5例患儿中检出典型融合转录本，其余患儿只能检出变异型转录本，可能是由于我们采用的PCR条件更适于变异型转录本的扩增。

　　E2A基因是淋巴细胞分化的重要调节基因，直接参与免疫球蛋白（Ig）基因重排，调节外周血成熟B细胞的Ig类别转换，同时也在多个阶段参与胸腺细胞的选择与分化［12，13］。E2A蛋白属于碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）家族，包含2个活化区，即AD1和AD2［14-16］，E2A-PBX1融合蛋白仍保留了这两个活化区。变异型融合转录本丢失了159bp，但没有影响开放阅读框，没有造成移码突变，因此仍将转录出融合蛋白，但丢失了53个氨基酸。值得注意的是，缺失的这53个氨基酸恰恰位于AD2区，将导致环-螺旋结构的部分丢失和七聚体亮氨酸重复结构的全部丢失［15，16］。

　　在HeLa细胞和酵母，环-螺旋结构具有活化功能［16］，七聚体亮氨酸重复结构可能参与和其它拉链蛋白的相互作用［15］。AD2区的完全缺失或七聚体亮氨酸重复结构的前2个亮氨酸的定点突变，将严重损害E2A蛋白的转化功能和/或反式活化潜能［15，17］。另一方面，AD2区具有功能选择性，其作用在胰岛β细胞更为重要［15］，而AD1区在许多其它组织包括淋巴细胞中具有重要作用［14］。因此，变异型融合蛋白的功能尚需深入研究。

　　【参考文献】

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