首先协助患者侧卧于病床上，背部与床面垂直。头向前胸部屈曲，双手抱膝紧贴腹部，使躯干呈弓形。
然后确定穿刺部位：一般取“双侧髂嵴最高点的连线”与“后正中线”的交点，即：第3～4腰椎棘突间隙作为进针部位。（也可上移或下移一个腰椎间隙）
完成上述步骤后，戴无菌手套，常规消毒皮肤2～3遍；消毒时以穿刺点为圆心，由内向外，消毒直径15cm的区域；
消毒后，覆盖无菌洞巾，选取2%利多卡因做局部浸润麻醉，先在穿刺点斜行进针，在皮下打一小皮丘，然后垂直缓慢进针，直至椎间韧带逐层麻醉。
局部浸润麻醉后，以左手固定穿刺点皮肤，右手持穿刺针，垂直背部缓慢刺入。进针深度成人约4～6cm（儿童则为2～4cm）。当针锋抵抗感突然消失时，表明针头已穿过硬脊膜，此时将针芯慢慢抽出，可见脑脊液流出；
然后连接测压管，测量脑脊液压力。正常情况下，侧卧位脑脊液压力为70～180mmH2O（或40～50滴／分钟）。
撤去测压管，将针芯插入穿刺针，再根据检测要求收集适量脑脊液送检。
最后，缓慢拔出穿刺针，用无菌纱布覆盖按压穿刺点3～5分钟，并用胶布固定。
穿刺结束后，嘱咐患者去枕平卧（也可取俯卧位）休息4～6小时，以避免引起低颅压性头痛。
