【摘要】  目的：探讨慢性肾衰患者高瘦素血症与瘦素基因表达及蛋白表达、肾小球滤过率、体质指数及炎症、空腹胰岛素之间的相关性。 方法：检测150例分别处于不同慢性肾功能衰竭阶段患者的血清瘦素水平、肾小球滤过率、同型半胱氨酸、C反应蛋白、空腹胰岛素的，并计算其体质指数。 RTPCR法检测15例终末期肾衰患者腹部脂肪组织瘦素基因表达；免疫组化法检测其瘦素蛋白表达。 结果：肾功能损伤患者血清平均瘦素水平明显高于健康对照组（P<0.01），与体质量指数之间呈正相关（P<0.01），与肾小球滤过率呈负相关（P<0.01）。 相关性分析发现血清瘦素与C反应蛋白、同型半胱氨酸及空腹胰岛素之间呈正相关（P均<0.05）。 终末期肾功能衰竭患者脂肪组织瘦素mRNA表达水平低于健康对照组（P<0.01），而蛋白表达高于健康对照组（P<0.01）。 血清瘦素水平与瘦素基因表达水平呈负相关（P<0.05）。 结论：慢性肾衰患者血清瘦素水平的升高与肾小球滤过率下降所导致的瘦素清除减少有关；终末期肾衰患者脂肪组织瘦素蛋白表达水平升高可能与慢性肾衰高瘦素血症有关。

　　【关键词】  瘦素；基因表达；肾功能衰竭，慢性；炎症；肾小球滤过率

　　0引言

　　瘦素（leptin）是由瘦素基因编码的肽类激素，与啮齿类动物及人类的食欲和能量代谢有关。 高浓度的瘦素可使食欲下降和能量消耗增加。 尿毒症患者广泛存在食欲下降和营养不良，但肾脏替代治疗不能完全改善上述状况，有研究认为这与高瘦素血症有关，而高瘦素血症可能与肾小球滤过率（glomerular filtration rate，GFR）下降， 炎症， 高胰岛素血症有关［1］， 但尿毒症患者血清瘦素水平增加的真正原因却仍在探讨之中。 本研究旨在通过对慢性肾衰（chronic renal failure， CRF）患者血中瘦素水平及瘦素基因表达的变化进行研究， 同时寻找引起这些变化的原因。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　150例患者中男89例，女61例， 均有不同程度肾损伤。 男性年龄（42±1）岁， 女性年龄（45±2）岁，其中原发性肾小球肾炎112例，慢性肾盂肾炎7例，多囊肾9例，糖尿病肾病17例，系统性红斑狼疮5例。 所有患者观察期间均停止使用类固醇及男性激素。 GFR<10 mL/min的患者采用血液透析治疗，2~3次/wk，4 h/次，碳酸盐透析液，血流量200~250 mL/min，透析液流量500 mL/min. 建议患者每日进食蛋白量为1.0 g/kg，蛋白摄入量由尿素动力学控制，不控制日常能量摄入。 30例健康自愿者作为健康对照组，男17例，女13例，年龄（44±1）岁，体质量指数相匹配。

　　1.2方法

　　①取血当日测量身长、体质量，计算体质量指数（body mass index，BMI）（BMI=体质量÷身长2），所有测量均由一人完成。 ②在控制条件下，留24 h尿，于次日清晨空腹状态下采静脉血2 mL，在本院生化检验室检测内生肌酐清除率。 ③于清晨空腹状态下采静脉血4 mL，血液透析患者透析前采血，取血后立即分离血清，置于-70℃冰箱中保存，待标本集齐后一次检测，检测血清瘦素浓度应用放射免疫分析法，试剂盒购于美国DSL公司。 一抗为兔抗人整分子瘦素的特异性多克隆抗血清，二抗为羊抗兔IgG血清。 ELISA方法检测血清C反应蛋白（Creactive protein，CRP）（试剂盒购于美国Biochech公司）。 荧光偏振免疫分析法检测血清同型半光胺酸（total homocystein，tHcy）（试剂盒及荧光偏振免疫分析仪均为美国ABBOTT公司产品）。 IMMVLITE180化学发光仪检测血清空腹胰岛素水平（fasting insulin，FINS）。 ④脂肪组织的获取：被测者禁食8h，15例维持性血液透析的终末期肾衰（endstage renal disease，ESRD）患者，男8例，年龄（42.5±5.7）岁，女7例，年龄（38.7±7.8）岁，均在进行肾移植手术切开腹部皮肤时取腹部脂肪2 cm3， 15例对照组均为腹腔镜下行胆囊切除术患者，BMI与15例ESRD患者相匹配，在手术时取腹部皮下脂肪2 cm3，脂肪组织立即液氮运送，-80℃保存待测。 另各取脂肪组织0.5 cm3，福尔马林固定，脱水后石蜡封存，待行免疫组化检测。 ⑤瘦素基因检测：用总RNA抽提试剂盒提取脂肪组织总RNA，操作步骤按说明书。 ⑥UltraSensitiveTM SP免疫组化法检测脂肪瘦素的表达：将标本石蜡块作5 μm厚的连续切片， 烤片， 脱蜡至水， 微波修复； 加入一抗体溶液， 1∶100兔抗人瘦素多克隆抗体Ob（A20）（Santa Cruz，USA），二抗体溶液，即用型免疫组化超敏UltraSensitiveTMSP试剂盒（鼠/兔）（KIT9710，福州迈新生物技术开发公司），阳性显色为棕色。 以PBS和一抗来源血清代替一抗作为阴性对照，以健康对照组腹部白色脂肪组织作为瘦素的阳性对照，每组切片随机选取5个区域，每个区域包含100个同类细胞，计量阳性结果，取平均数作为每张切片的阳性细胞数。

　　统计学处理：所有数据采用x±s表示。 组间比较采用方差分析或非参数秩和检验。 配对及组内比较采用配对的t检验。 指标间的相关性采用秩相关进行分析。 P<0.05表示有统计学差异。

　　2结果

　　2.1肾脏患者瘦素、GFR和BMI的变化及相关性

　　①不同程度肾功能损伤的150例患者，血清平均瘦素水平为（20.8±1.9） μg/L，高于健康对照（9.0±1.0） μg/L（P<0.01），与GFR（r=-0.26， P<0.01）及BMI（r=0.47， P<0.01）之间有相关性，而在GFR与BMI之间未发现相关性。 ②89例男性患者，血清平均瘦素（13.5±1.2） μg/L高于17例BMI相匹配的健康男性（4.7±0.4） μg/L （P<0.01），与GFR（r=-0.17， P<0.01）及BMI（r=0.56， P<0.01）之间有相关性，而GFR与BMI之间未发现相关性。 ③61例女性患者，血清平均瘦素水平（31.6±4.0） μg/L，高于13例BMI相匹配的健康女性（12.6±1.4） μg/L（P<0.01）。 与GFR（r=-0.44，P<0.01）及BMI（r=0.56，P<0.01）之间有相关性，而GFR与BMI之间未发现相关性。 ④正常GFR组（GFR>80 mL/min），中度肾功能损伤组（GFR 20~80 mL/min），重度肾功能损伤组（GFR<20 mL/min），中、重度肾功能损伤的2组血清瘦素水平明显升高，分别为（16.9±1.5） ng/mL和（27.7±3.6） ng/mL，与健康对照组比较P<0.01. 肾功能正常组的瘦素水平（25.2±0.8） ng/mL与健康对照组无统计学差异（P>0.05）。

　　2.2肾脏患者瘦素与CRP及tHcy，FINS的变化及相关性肾功能损伤不同阶段的CRP，tHcy，FINS有变化（表1）。 相关性分析发现血清瘦素与CRP（r=0.60， P<0.05），tHcy（r=0.57， P<0.05），FINS（r=0.60， P<0.05）之间呈正相关。表1不同程度肾功能衰竭患者tHcy，CRP和FINS的变化（略）

　　2.3ESRD患者瘦素基因表达及相关性

　　RTPCR显示15例ESRD患者与15例健康对照组瘦素mRNA的相对表达水平：瘦素RTPCR产物为220 bp，βactinRTPCR产物为392 bp. 瘦素mRNA与βActin mRNA表达水平之比在两组间有统计学差异，前者瘦素mRNA相对表达水平为0.347±0.136低于后者0.489±0.102（P<0.01，图1）。 15例ESRD患者中瘦素基因表达与血清瘦素水平呈负相关（r=-0.55，P<0.05），而CRP与瘦素基因表达之间无相关性（r=0.51， P=0.052）。

　　2.4脂肪组织免疫组化法

　　瘦素蛋白的表达免疫组化显示15例ESRD组患者与15例健康对照组脂肪组织瘦素表达， 瘦素表达水平在两组间有统计学差异， 15例对照组脂肪组织有瘦素表达的阳性细胞数为（35.37±14.89）%， 低于15例ESRD患者的瘦素阳性细胞数（61.70±22.96）%（P<0.05）。

　　3讨论

　　我们研究显示，中、重度肾功能衰竭患者血清痩素水平升高，高瘦素血症可能与肾脏清除功能下降有关。 慢性肾衰患者高瘦素血症可能通过反馈抑制使瘦素基因表达下降同时使脂肪组织瘦素蛋白表达增强。 人体脂肪增加及全身微炎症状态可能刺激瘦素产生增加。 高瘦素血症可能与慢性肾衰患者胰岛素抵抗有关。

　　瘦素通过其特异性受体及多种神经肽通路作用于中枢神经系统，影响机体众多生理活动和代谢途径，抑制食欲，增加能量消耗、调节胰岛素分泌、影响血管紧张素的作用、调节免疫系统功能［2］。 目前有部分研究发现ESRD患者无论是否进行透析其血清瘦素水平都进行性增加，且患者的脂肪并没有增加［3］，推测其食欲减退和营养不良与血清瘦素水平升高有关。 肾脏中有较高的瘦素短受体表达，和少量的长受体表达，瘦素可刺激肾小球上皮细胞、系膜细胞的增殖，给正常大鼠连续注射3 wk的瘦素可引起肾小球硬化和蛋白尿［2］，加速肾功能衰竭的发生。 循环中大于80%的瘦素经肾脏排泄，血中的内生瘦素可被肾小球快速滤过并由肾小管代谢降解，因此推测肾小球滤过率下降可能是瘦素水平升高的原因［4］。 Sharma等［5］检测了正常肾功能及肾功能受损患者的肾动脉及肾静脉的瘦素浓度，发现血液流经正常肾脏时瘦素浓度有一定程度下降，净排泄率为12％，而重度肾功能受损者净排泄率为零，这再一次肯定了肾脏对瘦素的排泄作用［6］。 因此我们仍认为肾功能衰竭是瘦素水平增高的原因之一。

　　从本研究发现tHcy，CRP在中、重度肾功能衰竭患者中显著升高。 且与瘦素水平呈正相关，这说明全身微炎症状态可能是造成CRF患者高痩素血症的另一原因。 Nordfors等［7］研究认为，在CRF患者中由于炎症状态可刺激瘦素基因表达，高瘦素血症通过负反馈机制抑制瘦素基因表达，而炎症可以破坏这种抑制。 但在我们的研究结果中CRP与瘦素基因表达之间并无相关性，这是否与病例的选择及数量有关需进一步研究。 对2型糖尿病患者的研究证实，胰岛素抵抗患者胰岛素水平增高直接导致血浆瘦素水平升高。 慢性肾功能衰竭时， 胰岛素抵抗和高胰岛素血症普遍存在， 血浆胰岛素水平高（>14 mU/L）的CRF患者与胰岛素水平低的患者比较， 前者的血浆瘦素水平明显高于后者［8］。 高瘦素血症可能与尿毒症患者胰岛素抵抗有关。

　　【参考文献】［1］TeplanV，Schuck O，Hajny J，et al. Obestiy and progression of chronic renal insufficiency：a czech long term prospective doubleblind randomized multicentre study［J］。 Vnitr Lek，2006，52（6）：571-576.

　　［2］Wolf G，Chen S，Han DC.et al. Leptin and renal dieases［J］。 Am J Kidney Dis， 2002， 39（1）：1-11.

　　［3］Necla B，Aysun B，Ozan O，et al. Leptin and resistin level and their relationships with glucose metabolism in children with chronic renal insufficiency and undergoing dialysis ［J］。 Nephrology （Carlton）， 2006，11（3）：192-196.

　　［4］Houshyar H，Manalo S，Dallman MF. Timdependent alterations in mRNA expression of brain neuropeptides regulating energy balance and hypothalamopituitaryadrenal activety after withdrawal from intermittent morphine treatment［J］。 J Neurosci，2004，24（42）：9414-9424.

　　［5］Sharma K， Considine RV， Beckie M， et al. Plasmaz leptin is partly cleared by the kidney and is elevated in hemodialysis patients ［J］。 Kedney Int， 1997， 51：1980-1985.

　　［6］庄文青，于俊生，罗兵， 等。 慢性肾功能衰竭大鼠瘦素、神经肽Y及其受体的基因表达［J］。 中国临床营养杂志， 2005，13（2）：70-74.

　　［7］Nordfors L，Lonnqvist F，Heimburger O，et.al. Low leptin gene expressionand hyperleptinemia in chronic renal failure［J］。Kidney Int，1998，54：1267-1275.

　　［8］Yoshimoto A，Mori K，Sugawara A， et al. Plasma ghrelin and Desacyl ghrelin concentrations in renal failure［J］。 J Am Soc Nephrol，2002，13：2748-2752.