【摘要】  目的：应用分子生物学技术，构建pIHsp65GM双顺反子真核表达质粒，并在真核细胞中表达。 方法：以结核分枝杆菌H37Rv株基因组为模板经聚合酶链反应（PCR）扩增出Hsp65基因，同时从质粒pORFhGMCSF中扩增出基因佐剂hGMCSF，分别克隆到真核表达载体pIRES的多克隆位点A（MCSA）和B（MCSB）中，构建pIHsp65GM真核表达质粒，并转染HepG2细胞中表达和检测。 结果：酶切鉴定提示插入的基因片段大小分别为1.64 kb和0.47 kb，测序分析表明克隆的Hsp65和hGMCSF序列与GenBank上公布序列完全一致；免疫组织化学方法检测到表达Hsp65的阳性细胞；ELISA方法检测到pIHsp65GM转染组细胞培养上清中hGMCSF的表达，与空载体对照组比较差异有统计学意义（P<0.01）。 结论：成功构建和表达了pIHsp65GM质粒，为研制优于卡介苗的新型抗结核病DNA疫苗奠定基础。

　　【关键词】  结核分枝杆菌；热休克蛋白65；人粒巨噬细胞集落刺激因子；双顺反子；基因佐剂

　　0引言

　　卡介苗（bacille calmetteguerin， BCG）是已被广泛应用于预防结核病（tuberculosis， TB）的减毒活疫苗。 由于结核DNA疫苗的制备简便、免疫效果好，目前已经成为TB的热门侯选疫苗之一［1］。 结核杆菌热休克蛋白65KD基因（heat shock protein 65KD， Hsp65）是研究最早的结核抗原之一，可以在动物体内对结核分枝杆菌的感染产生强烈的保护性免疫反应［2］。粒细胞吞噬细胞集落刺激因子（granulocytemacrophage  colonystimulating factor， GMCSF）作为良好的基因佐剂，可以利用其上调机体免疫水平的作用增强DNA疫苗的效能［3-4］。 虽然Hsp65抗原和GMCSF分别在感染免疫中的作用已经被研究证实有效，但对人GMCSF协同Hsp65抗原在结核杆菌感染中的免疫应答特点和保护力尚不清楚［5］。 我们将两者同时克隆到同一载体上，构建含结核杆菌Hsp65和基因佐剂hGMCSF的双顺反子真核质粒，旨在为进一步了解结核DNA疫苗的免疫效果奠定基础。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　结核分枝杆菌H37Rv株基因组，大肠杆菌DH5α，载体pIRES和质粒pORFhGMCSF（暨南大学医学院微生物学与免疫学教研室提供）；Ex Taq DNA聚合酶，T4 DNA连接酶，限制性内切酶Nhe I，EcoR I， Xba I和Not I，DL1 kb marker，质粒提取试剂盒，DNA凝胶回收纯化试剂盒（大连宝生物公司）；两对PCR引物、重组质粒上目的基因的序列测定由上海生工生物工程公司完成； Transmaster转染试剂（广州博理生物科技公司）；即用型免疫组化Biotin SPHRP试剂盒，DAB酶底物显色试剂盒（北京鼎国生物科技公司）；鼠抗人Hsp65蛋白单克隆抗体和人hGMCSF蛋白ELISA检测试剂盒（深圳市晶美生物科技公司）。

　　1.2方法

　　1.2.1目的基因

　　Hsp65和hGMCSF的PCR扩增参照GenBank上结核分枝杆菌H37Rv株Hsp65基因CDS序列（NCBI登陆号：M15467）分别设计引物进行PCR扩增。

　　1.2.2pIHsp65真核载体的构建与鉴定

　　将Hsp65的PCR产物经过回收纯化后与载体pIRES，同时用Nhe I和EcoR I双酶切，酶切后进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳，并经过凝胶回收纯化试剂盒回收酶切产物，将两者酶切纯化的产物按照3∶1的摩尔比混合，用T4 DNA连接酶连接24 h.转化用低温CaCl2制备的E.coli DH5α感受态细菌，然后涂布于含氨苄青霉素50 μg/mL的LB固体培养基中。次日，随机挑取10个单菌落，分别接种于3 mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃下150 r/min振荡培养过夜。先取少量菌液煮沸作为模板进行菌落PCR检测是否有Hsp65的存在，将菌落PCR筛选呈阳性的菌落用质粒提取试剂盒抽提质粒DNA.将提取的质粒DNA用Nhe I和EcoR I双酶切，进行电泳检测，以DL1 kb  marker为分子量参照， 将筛选出的阳性克隆产物的菌液进行测序鉴定。 测序采用Sanger双脱氧链终止法， 对插入序列的两端进行测定， 测序工作由上海生物工程公司完成。

　　1.2.3pIHsp65GM真核表达

　　质粒的构建与鉴定同构建pIHsp65载体方法一样，将hGMCSF的PCR产物经过回收纯化后与载体pIHsp65同时用Xba I 和Not I 双酶切，酶切产物经凝胶回收纯化后，将两者酶切纯化的产物按照3∶1的摩尔比混合，用T4 DNA连接酶连接24 h，然后转化感受态细菌E.coli DH5α，涂布于含氨苄青霉素50 μg/mL的LB固体培养基中。次日，随机挑取10个单菌落，分别接种于3 mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃下150 r/min振荡培养过夜。将菌落PCR筛选呈阳性的菌落用质粒提取试剂盒抽提质粒DNA.将提取的质粒DNA用Xba I 和Not I双酶切，进行电泳检测，以DL1 kb marker为分子量参照，将筛选出的阳性克隆产物的菌液进行测序鉴定。

　　1.2.4细胞转染

　　取对数生长期的HepG2细胞接种在12孔板内， 待细胞生长至70%～80 %时， 加入阳离子多聚体转染试剂Transmaster和质粒pIHsp65GM的混合物。饥饿培养1 h，加入含100 mL/L小牛血清的完全培养基，培养24 h后，检测Hsp65和hGMCSF蛋白的表达。

　　1.2.5Hsp65蛋白表达的免疫组化检测

　　采用未转染细胞为空白对照和转染了空质粒pIRES的细胞为阴性对照，将空质粒pIRES和重组质粒pIHsp65GM转染HepG2细胞48 h，去除培养液，用磷酸盐缓冲盐水PBS冲洗。经40 g/L的多聚甲醛固定后，依次滴加过氧化酶阻断剂，正常动物非免疫血清，1∶1000鼠抗人Hsp65蛋白抗体，生物素标记二抗和链霉素抗生物素蛋白。最后加入新鲜配制的DAB工作液染色，显微镜下观察结果，Hsp65蛋白的表达以细胞质染呈棕黄色者为阳性。

　　1.2.6ELISA法检测

　　hGMCSF蛋白表达水平分别收集pIRES和质粒pIHsp65GM转染24 h和48 h的HepG2细胞的细胞培养的上清液，采用ELISA双抗体夹心法检测hGMCSF蛋白的表达量，按照试剂盒说明进行操作。用酶标仪在吸光度A450 nm下测定样品和试剂盒提供的标准品的A值。根据标准品所测A值绘制的蛋白浓度与A值相关标准曲线计算各样品中hGMCSF蛋白的含量（以空白孔调零）。

　　统计学处理：实验数据以x±s表示，采用SPSS 13.0软件包进行分析，组间比较采用两样本t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

　　2结果

　　2.1Hsp65和hGMCSF基因PCR扩增产物电泳分析

　　琼脂糖凝胶电泳结果显示，PCR产物分别为1.64 kb和0.47 kb的特异性片段，与预期Hsp65和hGMCSF基因大小相符（图1）。

　　2.2重组质粒限制性内切酶消化鉴定

　　质粒pIHsp65经Nhe I和EcoR I双酶切后，电泳可见大小约6.1 kb与1.64 kb两片段，与载体pIRES经Nhe I和EcoR I双酶切产物和Hsp65基因PCR产物的2条特异性条带对比，大小相符（图2A）。重组质粒pIHsp65GM经Xba I 和Not I双酶切后，电泳可见大小约为7.74 kb与0.47 kb两片段，与质粒pIHsp65经Xba I和Not I双酶切产物和hGMCSF基因PCR产物的2条特异性条带对比，大小相符（图2B）。

　　2.3序列分析鉴定

　　对质粒pIHsp65上的多克隆位点A（multiple cloning sites A，MCSA）内的DNA序列进行序列分析鉴定，结果与结核分支杆菌H37Rv株的Hsp 65的基因序列完全相同。对质粒pIHsp65GM上的多克隆位点B（multiple cloning sites B， MCSB）内的DNA序列进行序列分析鉴定， 结果与hGMCSF的基因序列完全相同。

　　2.4Hsp65蛋白在HepG2细胞中的表达

　　显微镜下观察，与未转染细胞的空白对照和转染空质粒pIRES细胞的阴性对照对比，pIHsp65GM转染的部分HepG2细胞中胞质染呈棕黄色，表明Hsp65表达呈阳性（图3）。

　　2.5ELISA检测

　　pIRES对照组在转染24和48 h时细胞上清液hGMCSF的表达量分别为（1.371±0.083） pg/mL和（1.782 ±0.127） pg/mL （n=3），而pIHsp65GM在转染24和48 h时细胞上清液hGMCSF的表达量分别为（271.103 ±4.731） pg/mL和（253.124±3.943）pg/mL；pIHsp65GM转染组在转染24和48 h时hGMCSF的表达量与pIRES对照组比较，差异均有统计学意义（P<0.01）。

　　3讨论

　　近年来，对结核研究最多的抗原主要有Hsp65，Ag85B， ESAT6和MPT64等［6-7］。其中Hsp65具有免疫优势抗原的特性，能诱导和增强机体的体液免疫和细胞免疫的发生，并可激活γδT细胞，分泌高水平的IFNγ和杀伤感染的细胞，是人体感染结核杆菌以后免疫系统的主要靶抗原，是T细胞攻击的主要对象［8］。 由于仅含有单抗原基因的DNA疫苗并不足以引发良好的免疫效果，还需要结合其他的手段如基因佐剂，特别是将细胞因子与DNA疫苗共表达才能产生更强的免疫保护力。 GMCSF作为DNA疫苗的免疫佐剂，能够调节树突状细胞的分化和成熟，以及MHC和共刺激分子的表达水平，并且通过调节抗原提呈细胞尤其是树突状细胞的数量和功能来调节免疫应答的强度。有研究认为将GMCSF作为佐剂与基因疫苗共同免疫小鼠结果比单独应用基因疫苗产生更强烈的细胞免疫应答并可提供更强的免疫保护力［3-5］。本实验采用载体pIRES为双顺反子真核表达质粒，在上下游克隆位点之间的序列为内部核糖体进入位点， 此段序列在转录后能够自动断裂， 使上下游克隆位点插入的基因能够独立高效的表达，从而避免了融合表达蛋白活性低下问题， 为两种蛋白表达、动物实验和结核疫苗研制提供较大方便。

　　与以往结核DNA疫苗的研究比较，本实验具有以下特点：①实现了目的基因与细胞因子基因在同一载体上共同表达。如果将DNA疫苗与编码GMCSF的质粒混合注射会对DNA疫苗的免疫效果产生干扰作用；若将GMCSF与目的基因共同克隆到一个载体中，由于两个基因具有相同的局部微环境，往往可以获得较好的免疫效果［9］。②本研究使用双顺反子真核表达载体pIRES，将两个基因分别克隆到两个多克隆位点，两者各自表达，不相互影响蛋白表达的空间结构。因为表达为融合产物的DNA疫苗可能破坏抗原的三维结构，对抗体的生成产生负面影响［10］。

　　【参考文献】［1］Mustafa AS. Development of new vaccines and diagnostic reagents against tuberculosis ［J］。 Mol Immunol， 2002，39：113-119.

　　［2］Baek KM， Ko SY， Lee M， et al. Comparative analysis of effects of cytokine gene adjuvants on DNA vaccination against mycobacterium tuberculosis heat shock protein 65［J］。 Vaccine， 2003，21（2526）：3684-3689.

　　［3］Zhang XZ， Maziar D， Patricia N， et al. Intramuscular immunization with a monogenic plasmid DNA tuberculosis vaccine： Enhanced immunogenicity by electroporation and coexpression of GMCSF transgene［J］。 Vaccine，2007，25（7）： 1342-1352.

　　［4］Qiu JT， Chang TC， Lin CT， et al. Novel codon optimized GMCSF gene as an adjuvant to enhance the immunity of a DNA vaccine against HIV1 Gag［J］。 Vaccine， 2007，25（2）： 253-263.

　　［5］Hongxun S， Vladimir MP， Corey M， et al. Regional， but not systemic recruitment/ expansion of dendritic cells by a pluronicformulated Flt3ligand plasmid with vaccine adjuvant activity［J］。 Vaccine， 2003，21（26）：3019-3020.

　　［6］师长宏，范雄林，柏银兰，等。 结核分枝杆菌Ag85BESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答及其保护力［J］。第四军医大学学报，2004，25（18）：1633- 1636.

　　［7］师长宏，安家泽，唐小凤，等。 结核分枝杆菌MPT64ESAT6融合蛋白在小鼠内诱导的免疫应答及其保护力［J］。第四军医大学学报，2006，27（9）：769-771.

　　［8］Lima KM， Santos SA， Lima AM， et al. Single dose of a vaccine based on DNA encoding mycobacterial hsp65 protein plus TDMloaded PLGA microspheres protects mice against a virulent strain of mycobacterium tuberculosis［J］。 Gene Ther，2003，10（8）：678-685.

　　［9］李忠明。当代新疫苗 ［M］。北京：高等教育出版社，2001：163-164.

　　［10］Hildegund CJE. DNA Vaccine ［M］。Translated by Li QH， Liu LD， Che YC， Beijing： Chemistry Industry Press，2005：387-389.