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    「进展」急性胰腺炎的现代概念

    从腺泡细胞损害到全身炎症反应：急性胰腺炎的现代概念

    是什么启动了胰腺炎？

    自100多年前胰腺自消化学说产生以来（1），出现了许多有关急性胰腺炎发病机理和病生改变的理论。当前许多的假说集中在急性胰腺炎发病早期胰腺腺泡细胞所发生的改变上（2）。众多的研究结果证明胰蛋白酶的活化是急性胰腺炎发病早期的关键。Whitcomb（3，4）等的实验结果强烈支持这一观点。他们首次发现阳离子胰蛋白酶原的基因突变。并且这些突变绝大多数发生于慢性遗传性胰腺炎病人家族中（3，4）。氨基酸互换的生物化学揭示：表现型胰蛋白酶更易被激活，这是当今深入研究的焦点。虽然近年最重要的发现之一，胰蛋白酶突变，并不能解释未成熟消化酶是如何被激活的问题，但人们仍在进行对这些疾病如何扩散或限制扩散到腺泡细胞的过程进行评估。然而，在这个导致胰腺自我消化的炎症反应链中起作用的可能不止一个因素。在急性胰腺炎动物模型中已观察到了数个腺泡细胞阻止分泌和随后自我消化的途径。这些机理包括未成熟腺泡的活化（5）。酶原和溶酶体的共区域化，以及随后的溶酶体酶的重分布，细胞内钙的持续升高（6，7）。纤维型肌动蛋白尖端的破裂（8，9）以及转录因子NF-kB的活化（10）。问题依然是：这些因素中到底哪一个因素是造成胰腺炎的发生和发展的必要因素。

    未成熟胰蛋白酶是如何被激活的？

    胰蛋白酶的活化在急性胰腺炎发病早期的作用非常重要，这一点没有争论。然而，是什么激活未成熟胰蛋白酶的并不完全清楚。亚细胞定位的胰蛋白酶原的活化是当前讨论的焦点。胰蛋白酶原在内织网合成并转运到高尔基体。在高尔基体此蛋白和其他消化酶一起形成颗粒并储存。胰蛋白酶原的活化是靠水解N端10个氨基酸来完成的。劈开的区域称为胰蛋白酶原活化肽（TAP）。从胰蛋白酶原移除的TAP通过诱导构象改变显露出分子活性。TAP区域不同于原胰蛋白酶原的单纯的氨基酸伸展，并且用特殊的抗体可以检测到。人们早就发现探测到的TAP作为人活动性急性胰腺炎活化的早期标志与临床密切相关（11）。因此，TAP的免疫检测已被用于检测胰蛋白酶活动的亚细胞位点。在受到促分泌物质超剂量的刺激时，胰蛋白酶与局部TAP位点一起发生反应。一种共定位理论的假说认为胰蛋白酶活化发生在包含有消化酶和溶酶体酶（如组织蛋白酶的胞浆空泡小体内。Hofbauer（12）和Otani等（13）在溶酶体标记物（GRAMP-92）和组织蛋白阳性的胞浆小泡内检测到了抗TAP的免疫反应。组织蛋白酶B是一种溶酶体酶，能从胰蛋白酶原中去除TAP区域。结果组织蛋白酶B可以在特定的细胞器内活化胰蛋白酶。对于组织蛋白酶B在试验性胰腺炎中的重要作用的研究结果不统一。至少，鼠胰腺胰蛋白酶对超大量蛙皮素刺激的反应似乎与组织蛋白酶B有关（14）。Halangk等（15）经过仔细的研究，用基因模型进一步证实了组织蛋白酶B在腺泡中对胰蛋白酶的活化作用。他证实缺少溶酶体内组织蛋白酶B小鼠的胰蛋白酶活性和胰腺坏死的程度均比野生小鼠明显减低。组织蛋白酶B受破坏的小鼠并不能完全阻滞胰蛋白酶的活化，这表明还有另外的机理或其他溶酶体蛋白酶（组织蛋白酶H或S）的未成熟活化。有趣的是，在组织蛋白酶B缺少的小鼠，胰蛋白酶原活性的下降与腺泡细胞受损有关。但是，全身炎性反应在去除组织蛋白B小鼠并不减轻。这留下了一个重要的问题：到底是否在胰腺腺泡中胰蛋白酶未成熟活化就足以启动瀑布反应从而导致胰腺炎。或者，是否单独的因子在急性胰腺炎的发病中就能激活全身炎性反应？

    血钙持续升高，是病因还是协同因素？

    对胰腺炎早期胰蛋白酶活性与细胞内钙相互作用的研究越来越受到人们的重视。早期胰腺炎的研究显示，高浓度钙可导致腺泡细胞损害。促分泌物超大剂量刺激可导致细胞内钙水平持续上升。但高浓度钙可导致胰蛋白酶原的自我活化。一些新进的研究集中在细胞内钙与腺泡细胞胰蛋白酶原活性之间的相互关系上。Kryger等（16）用荧光活性探针研究胰蛋白酶的活性，发现在超大剂量胆囊收缩素刺激下，未成熟胰蛋白酶活化起始于腺泡细胞顶端。这个活化高度地依赖于同一个亚细胞结构内钙离子释放的空间和聂temporal 的分布。其余的腺泡细胞中失活的胰蛋白酶储存在于腺泡细胞顶端的酶原颗粒中。生理剂量促分泌物CCK颗粒的刺激是胞浆外种钙依赖方式进行的。在这种情况下，repetitive calcium transients反复的短瞬钙被激活，正常情况下颗粒内的胰蛋白酶不能被这种钙依赖方式激活。应用超大剂量的CCK，胰蛋白酶开始在腺泡细胞顶端的一个严格限制的区域内被活化。该离子的这个作用只能在峰值或平台期Ca2+释放时才能观察到。但并不是一个波动的方式。同样，作为对超大剂量蛙皮素刺激的回报，钙离子的持续升高也可激活空泡形成。胰蛋白活化和空泡的形成能被Ca2+信号阻断。这些研究标明在急性胰腺炎中钙离子的持续的升高是一个重要的协同因子。钙毒性可由于ATP耗竭或钙依赖水解酶的过渡活化。钙离子的病理生理作用可能并不仅限于消化酶的未成熟活化，因为高钙浓度可以破坏细胞骨架并导致腺泡细胞的空泡形成。

    是什么诱导细胞骨架的破坏？

    急性胰腺炎最早损害之一包括导管、腺泡细胞骨架和紧密联结结构的破坏。在超大剂量蛙皮素刺激后不久就可观察到来源于胰腺腺泡细胞膜的肌动蛋白的释放。这个分解提供一个有趣的概念来解释消化酶的细胞内转运的紊乱和细胞周围通透性的增加（如侧膜分泌和活化的胰酶的向间质和血管周围的释放）。微管和微丝的分解和降解可以导致蛋白分类错误和空泡形成。锚定肌动蛋白的一个重要的蛋白质复合物是连接相邻细胞的粘连连接。极性细胞相互间的接触是由上皮细胞钙粘连蛋白介导的。与上皮细胞钙粘蛋白结合的跨膜位点为钙依赖性。上皮细胞钙粘蛋白与来自于链蛋白家族的蛋白结合形成复合物（17）。上皮细胞钙粘连蛋白的细胞内位点通过á-catenins with the p120 catenin（结合上皮钙粘蛋白的cytoplasmatic juxtamembrane区域）的相互作用对细胞骨架起到一个固定所用。胰腺的上皮细胞钙粘蛋白与-catenin局限于腺泡细胞。超大剂量蛙皮素刺激导致两种蛋白在连接周围去连接dissociation， 内在化和降解。Leser（19）等研究锚定细胞骨架是如何被破坏的分子机制。已经在不同的细胞成分中观察到链蛋白的酪氨酸磷酸化。- or ácatenins的磷酸化可稳定细胞骨架，p120链蛋白的酪氨酸磷酸化可使其与catenin/cadherin结合形成复合物对肌丝蛋白不稳定。超大剂量蛙皮素浓度导致p120粘连结合蛋白在终端肌动蛋白未损坏之前磷酸化。P120的磷酸化在粘连结合的裂解中似乎是一个重要的步骤。在超大剂量蛙皮素刺激后2分钟以内发生酪氨酸磷酸化，并且可能是激动蛋白自细胞质膜释放的反应，在超大剂量分泌刺激物刺激后数分钟内即可观察到。

    NF-kB是保护因子还是破环因子？

    在实验性胰腺炎中转录因子NF-kB被迅速激活。NF-kB是细胞因子过剩的转录中介并且与细胞凋亡有关（20）。早在超大剂量蛙皮素刺激后10分钟以内即可测到胰腺腺泡细胞中激活的NF-kB（10）。导致NF-kB活化的确切机制尚不清楚。应用特异阻止剂的单细胞实验证实蛋白激酶C和钙离子是NF-kB活化的重要的因素（21）。有一些线索显示Raf-激酶反应和/或应激激酶与活化NF-kB有关。然而，并未建立直接的分子联系（22）。NF-kB的活化导致I-kB的磷酸化和降解。这个过程伴随signalosom composed of IKK？， IKK ， and NEMO.由于I-kB的降解能在实验性胰腺炎的腺泡中观察到，所以很可能存在IKK的活化。在实验性胰腺炎中NF-kB活化的结果尚不清楚。有一个假说假定胰腺腺泡NF-kB的活化是细胞因子合成的必要条件，象TNF或黏附分子（23）。粘附分子的表达和旁分泌细胞因子依次吸引免疫活性细胞到达胰腺。这个瀑布效应最终导致强烈的炎症反应以及全身的炎症反应。相反，一些观察反对NF-kB在急性胰腺炎中的保护作用。用N-乙酰-L-半胱氨酸和其他NF-kB或IKK的阻止剂可导致促分泌素诱导的胰腺炎减轻（10）。PAP表达可预防TNF诱导的AR42J细胞的凋亡。在这个系统中，抗凋亡作用依赖与NF-kB和MAP激酶的活性（24）。在实验性胰腺炎不同的细胞中，NF-kB活化有可能具有不同的作用。在蛙皮素胰腺炎在体活化NF-kB的生化分析显示双向反应：NF-kB在对CCK过度刺激反应的很早期就已经被激活。在大约8-12小时的高峰后活性逐渐减低。在体的基因测定发现第二个高峰是由炎症细胞移动到炎症部位造成。NF-kB在这些细胞的活化可能是腺泡细胞和免疫细胞产生的细胞因子的旁分泌和juxtacrine作用的结果。这些细胞因子。这个假设受到胰腺腺泡细胞在受到超量刺激时产生TNF，一个有力地NF-kB中介，的支持（25）。在急性胰腺炎中不同类型细胞NF-kB活化的动力学不同可能会解释不同的发现，并且，更有甚者，提供治疗干预的可能性。

    从局部炎症到全身疾病

    虽然在急性胰腺炎腺泡细胞内的变化能迅速导致亚细胞结构的破坏。但在胰腺炎过程中，许多其他细胞也迅速被牵涉进入胰腺炎发病过程。尤其免疫细胞，如：粒细胞，淋巴细胞和巨嗜细胞，在此过程中与受损的胰腺腺泡细胞相互作用。此外不同细胞的体液因子也参与疾病的全身播散从而导致严重的器官功能不全，如：肺损害。从损伤的腺泡细胞释放的细胞因子激活免疫活性细胞的炎性反应，并从此发展成全身炎性反应综合征。这个放大作用的一个例子就是细胞因子经胰腺释放到门体循环。这些细胞因子依次活化肝Kuffer细胞。后者作为回应增加细胞因子产生。这些肝细胞因子又进一步增进急性相蛋白合成并进而产生像肺损伤等严重器官功能不全。

    细胞因子作为炎症反应的介质

    一个未解决的问题是胰腺炎是如何导致免疫系统过度反应的？在实验性急性胰腺炎局部炎症介质包括单核细胞趋化蛋白（MCP-1）和TNF基因。随后，主要通过中性粒细胞释放IL-1，IL-6和IL-8以导致肝内急性相蛋白合成。肝Kupffer细胞也刺激并产生细胞因子，已导致器官功能不全（27，26）。在急性胰腺炎中细胞因子对器官衰竭的作用的证据来源于鼠模型中受累的趋化因子受体CCR-1的破裂。删除大鼠CCR-1与保护继发于急性胰腺炎的肺炎症有关。预防肺损伤与TNF水平以当时的序列的下降有关。这表明CCR-1受体的活化是全身炎症反应综合征的早期表现（28）。有趣地，胰腺的其他细胞类型也与炎症因子中介的的局部放大有关。在人类腺泡旁肌成纤维细胞IL-1、TNF能活化转录因子NF并促进化学增活素，如：MCP-1、RANTES和IL-8的表达和分泌。腺泡周围肌成纤维细胞代表胰腺细胞的数量，这可能与相应的胰腺星状细胞相关（29）。趋化的细胞因子可能启动并扩大局部炎症反应并吸引炎性细胞到胰腺。依据试验显示NF-kB在这个过程中阻止转录因子减少趋化表达（30）。

    免疫细胞在胰腺炎中的作用

    由体液因子介导的免疫活性细胞的趋化作用在胰腺疾病的播散中是一个重要的步骤。Rinderknecht假设严重胰腺炎是由于中性粒细胞的强刺激引起的（31）。中性粒细胞的浸润与急性胰腺炎IL-1的产量有关。而且，在急性胰腺炎中，中性粒细胞的损耗可使肺损伤的严重程度减轻（32，33）。目前并不能解释其中的机理。在促分泌素胰腺炎中细胞内黏附分子1（ICAM-1）的上调可能与NF-kB活化相关并在实验性胰腺炎中与噬中性粒细胞有关。超大剂量Cerulean的刺激可致胰腺腺泡细胞ICAM-1上调（34）。这些表面分子介导的中性粒细胞黏附到炎症部位（23）。虽然在急性胰腺炎中发现巨嗜细胞是主要细胞，T淋巴细胞在炎症部位也有小比例的存在。越来越多的证据显示：活化的T淋巴细胞对于传播急性胰腺炎是必要的。急性胰腺炎CD4/CD8比例的改变提示CD4Th淋巴细胞在疾病过程中的作用。应用老鼠模型的遗传概念，Demols（35）等证实CD4阳性Th淋巴细胞可改善促分泌素介导的胰腺炎。T淋巴细胞在胰腺病理中作用的重要性得到Th1型免疫反应和人类自身免疫型胰腺炎中自身抗体增加的证实（36）。

    胰腺炎是自我防护的吗？

    在人类急性胰腺炎具有广泛的临床变化，仅仅病人中的一小部分发展成为重症胰腺炎，很早即出现器官功能不全和功能衰竭。关于胰腺腺泡细胞限制病情发展或阻止自我消化的内源因子所知甚少。近年来，在试验型胰腺炎中，热休克蛋白（HSPs），一个可能的自我防御机制已经引起了大家的注意。在生理条件下，HSPs或分子伴侣部分控制着折叠和新合成蛋白的装配。这些蛋白并不仅仅与蛋白合成有关，还在各种不同的细胞应激中防护细胞（37，38）。大鼠的超大剂量的蛙皮素刺激可致70-kD级HSPs的中等量的上调（39）。这个上调明显不足以限制疾病抵达胰腺。在小鼠和大鼠用热、溺水等应激刺激诱导HSPs的表达可缓解的试验型胰腺炎（40，41）。虽然有证据表明60kD的家族中HSPs也起着重要的作用。在急性胰腺炎中不同HSP的单独作用并不完全清楚（42）。有一些HSPs介导的细胞保护的分子机制的线索。分子伴侣可能帮助恢复蛋白的损害和可能限制腺泡内紊乱的错误路线蛋白。Bhagat 等（43）报道HSPs的过度表达尤其70-kD家族的过度表达，能防御妨碍胰岛素活性的腺泡细胞损伤。这个观察发现HSPs的表达与早期胰腺炎链级反应有关。确切的机理仍然不清楚，部分原因是体外HSPs表达的模型不多。虽然在体内用像溺水对于诱导高水平的HSPs是有效的，但这个途径对于观察HSPs上调作用是不够全面的。最近Hietaranta （44）等的研究表明，无论在体外或体内，溺水能有效地减少NF-kB在超大剂量蛙皮素刺激后的活性。有趣地是，溺水应激对TNF诱导的NF-kB的活化无效。细胞内钙信号对于超大剂量蛙皮素刺激的反应在提前溺水的刺激下，明显减低，这表明溺水的一些作用可能与细胞内钙调节有关（44）。



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